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Forschungsaktivitäten 2009:

I.    Laktationsphysiologie

II.   Reproduktionsbiologie

III.  Lebensmittelsicherheit, Ernährung und Umwelt

IV.  Wachstumsphysiologie, myotrope Therapeutika und Anabolika

V.   Wildtierbiologie

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I. Laktationsphysiologie

Cholesterolsynthese in der laktierenden Kuh: Induzierte Expression von Kandidatengenen
Cholesterol synthesis in the lactating cow: Induced expression of candidate genes
Viturro, E.; Koenning, M.; Kroemer, A.; Schlamberger, G.; Wiedemann, S.; Kaske, M.; Meyer, H.H.D.: Biochemistry and Molecular Biology 115 (2009) 62-67
Trotz umfangreichen Wissens bei anderen Tierarten sind die Mechanismen vom Cholesterinstoffwechsel im Wiederkäuer noch unklar. Große Unterschiede in der Milchcholesterin-Konzentration zwischen Rassen, Management Strategien, Individuen und Zeitpunkt der Laktationzyklus sind bekannt, aber die genetischen Akteure in diesem Prozess wurden nicht identifiziert. Da Wiederkäuer kein Cholesterin mit ihrer Nahrung erhalten, ist das Verständnis der Mechanismen der Syntheseregulation und des Transports in die Milch entscheidend, um die Höhe dieses Metaboliten in Milchprodukten zu reduzieren. Ziel unserer Arbeit ist die Expression von Kandidatengenen für diese Prozesse in der Leber vom Bos taurus während des laktierenden Zyklus zu erforschen. Leberbioptate wurden von 16 erwachsenen Brown Swiss Kühen zu verschiedenen Zeitpunkten gewonnen (2 Wochen vor sowie 0, 2, 4 und 8 Wochen nach der Kalbung). Nach RNA-Extraktion und Reverse Transkription wurde die Genexpression von Kandidatengenen mittels quantitativer PCR untersucht. Schlüsselenzyme der Cholesterin-Synthese (3-Hydroxy-methyglutaryl-Coenzym-A (HMG-CoA)-Synthase, HMG-CoA-Reduktase und Farnesyldiphosphat-Farnesyltransferase (FDFT)) und Genexpressionregulatoren (Sterol regulatory element bindende Proteine (SREBP1and 2) SREBP-Spaltung aktivierendes Protein (SCAP)) wurden als Kandidaten-Gene ausgewählt. Die Expression von HMG-CoA-Reduktase und FDFT war bis Woche 2 nach der Kalbung stark erhöht (p <0,01); vermutlich als Reaktion auf die neuen Anforderungen in der Milchdrüse. Ein möglicher Grund für diese Änderungen ist eine Erhöhung der SREBP1- und SCAP-Expression (p <0,01 und p <0,05). Die ganzen Syntheserouten zeigten eine koordinierte Regulation. Es wurden hoch signifikante positive Korrelationen zwischen der Expression von den oben genannten Enzymen gefunden (p <0,01). Der Anstieg des Milch- und Cholesterinspiegels im Blut in Bos taurus nach der Geburt könnte das Ergebnis einer koordinierten Induktion der Expression wichtigster Leberenzyme sein.

Analyse der Schlüsselmoleküle des angeborenen Immunsystems in Milchdrüsenepithel-zellen isoliert von Markern assistierter und konventionell selektierten Kühen
Analysis of key molecules of the innate immune system in mammary epithelial cells isolated from marker-assisted and conventionally selected cattle
Griesbeck-Zilch, B.; Osman, M.; Kühn, Ch.; Schwerin, M.; Bruckmaier R.H.; Pfaffl, M.W.; Hammerle-Fickinger, A.; Meyer, H.H.D.; Wellnitz, O.: Journal of Dairy Science 92 (2009) 4621-4633
Mastitis ist die häufigste Infektionserkrankung in Milchviehherden, und es wurde mehrfach versucht mit Hilfe von Zuchtprogrammen die Mastitisrate zu reduzieren. In den vergangenen Dekaden basierte die Selektion insbesondere auf phenotypischen Charakteristika, wie die Zahl somatischer Zellzahlen. Seit kurzem wird versucht auf der Basis von Mastitis assoziierten QTL (quantitative trade loci) zu selektieren. In unserer Studie sollte untersucht werden, inwieweit der auf Chromosom 18 des Rindes gefundene QTL die Genetik der Eutergesundheit beeinflusst. Primäre Zellkulturen aus Milchdrüsengewebe von Färsen, die auf hohe und niedrige Mastitissuszeptibilität selektiert worden waren, wurden etabliert. Die Selektion basierte auf einer Zuchtwerteinschätzung auf Basis des QTL. Die mRNA Analyse von 10 Schlüsselmolekülen des angeborenen Immunsystems wurde mit Hilfe der quantitativen RT-PCR nach Pathogenzugabe (E. coli und S. aureus) untersucht. In der Marker assistierten Selektionsgruppe war die mRNA Expression für den toll-like Rezeptor 2, für RANTES, für 4 weitere Cytokine, sowie für Lactoferrin erhöht. Diese Ergebnisse geben einen ersten Hinweis auf eine genetische Grundlage bei der Pathogenabwehr in der Milchdrüse. Sie geben Hoffnung, dass der gefundene QTL eine Grundlage für die Züchtung mastitisunanfälliger Kühe ist.
könnte das Ergebnis einer koordinierten Induktion der Expression wichtigster Leberenzyme sein.

Bestimmung von Oxytocin in der Milch von Kühen nach Oxytocinapplikation
Determination of oxytocin in milk of cows administered oxytocin
Prakash, B.S.; Paul V.; Kliem, H.; Kulozik, U.; Meyer, H.H.D.: Analytica Chimica Acta 636 (2009) 111-115
In der Studie wurde überprüft, ob Oxytocin, das in der Praxis zur Induktion der Milchejektion appliziert wird, in die Milch transferiert wird. Dazu wurde ein hoch sensitiver Enzym-Immuno-Assay (EIA) für die Bestimmung des Oxytocin im ppt-Bereich in Milch entwickelt und nach den aktuell gültigen EU-Kriterien (2002/657/EC) validiert. Von 38 Tieren wurden nach der Gabe von 25 oder 50 IU Oxytocin Milchproben gesammelt. Bei beiden Gruppen wurde kein signifikanter Anstieg des Oxytocin in der Milch aus dem aktuellen und den folgenden Gemelken gefunden. Schlussfolgernd ergibt sich, dass keine relevanten Oxytocinmengen in die Milch transferiert werden.

II. Reproduktionsbiologie

Differenzierungsvorgänge des Endometriums während des Zyklus ermöglichen die Bereitstellung eines geeigneten Milieus für die Etablierung der Gravidität. Verantwortlich hierfür sind endokrin und parakrin kontrollierte Vorgänge, die das uterine Milieu während der Gelbkörperphase regulieren. Die systematische Erfassung von Wechselwirkungen zwischen frühen Embryonalstadien und ihrer mütterlichen Umgebung zeigen an, dass embryonale Signale selbst eine zeitliche und räumliche Abfolge von Ereignissen im Uterus initiieren und damit zur erfolgreichen Fertilisierung, Embryonalentwicklung und Implantation beitragen. Für die Untersuchungen wurde die Gebärmutter zyklussynchronisierter Tiere vom Zyklus- bzw. Trächtigkeitstag 12, 15 und 18 vor der Eröffnung und der Probenahme des Endometriums gespült, um die uterine Milch zu gewinnen.

Hinweise für eine östrogen-abhängige Expression von uterinem Serpin (SERPINA14) während der Brunst im bovinen endometrialen Drüsenepithel und dem Lumen der Gebärmutter
Evidence for estrogen-dependent uterine serpin (SERPINA14) expression during estrus in the bovine endometrial glandular epithelium and lumen
Ulbrich, S.E.; Frohlich, T; Schulke, K.; Englberger, E.; Waldschmitt, N.; Arnold, G.J.; Reichenbach, H.-D.; Reichenbach, M.; Wolf, E.; Meyer, H.H.D.; Bauersachs, S.:
Biology of Reproduction 81 (2009) 795-805
Das zeitlich und lokal differenzierte Auftreten des uterinen Serpins A14 (uterines Milchprotein) stand im Mittelpunkt der Analyse eines prominenten sekretorischen Proteins des Endometriums, welches bislang bei Wiederkäuern nur im Zusammenhang mit der späten Trächtigkeit beschrieben wurde und in initialen Transkriptomuntersuchungen aufgefallen war. Es konnte auf mRNA und Proteinebene mittels eines eigenen AK überzeugend dargestellt werden, dass SERPINA14 insbesondere Estradiol-17ß-abhängig während des Östrus sowohl in den glandulären Drüsen des Endometriums als auch der uterinen Spülflüssigkeit bzw. des Brunstschleims vorkommt. Eine primäre endometriale Zell-Kokultur von glandulären epithelianen und stromalen Zellen wurde zusätzlich erstellt, um den Nachweis der von Steroiden abhängigen SERPINA14 Genexpression zu führen. Damit ist eine Interaktion von SERPINA14 mit den frühen Gameten wahrscheinlich.

Quantitative Charakterisierung der Proastaglandine in der Gebärmutter früh-trächtiger Rinder
Quantitative characterization of prostaglandins in the uterus of early pregnant cattle
Ulbrich, S.E.; Schulke, K.; Groebner, A.E.; Reichenbach, H.D.; Angioni, C.; Geisslinger, G.9; Meyer, H.H.D.:
Reproduction 138 (2009) 371-382
Prostaglandine werden vom Endometrium bei Ausbleiben einer Trächtigkeit sezerniert, damit der zyklische Gelbkörper abgebaut und ein neuer Zyklus initiiert werden kann. Da luteolytisch wirksam, gilt PGF2alpha während der frühen Trächtigkeit in diesem Zusammenhang als äußerst bedenklich. Unsere durchgeführte Analyse der uterinen Spülflüssigkeiten mittels LC/MS-MS zeigte, dass nicht nur während des Zyklus das luminale Milieu von 6-keto PGF1alpha (stabler Metabolit von PGI2) und PGF2alpha dominiert wird, sondern dass zwischen den Tagen 12 und 15 während der Trächtigkeit ein besonders großer Anstieg an 6-keto PGF1alpha > PGF2alpha > PGE2 > PGD2 ~ TXB2 stattfindet. Gleichsam ändert sich das Verhältnis von PGF2alpha zu PGE2 im uterinen Lumen während der frühen Trächtigkeit zugunsten von PGE2 nicht, obgleich man bislang nur PGE2 eine embryotrophe Wirkung zugeschrieben hat. Dies ist deshalb von besonderer Bedeutung, da nun angenommen werden kann, dass PGF2alpha für den Embryo nicht schädlich, sondern möglicherweise nützlicher ist als bisher geglaubt. Es bleibt zu überprüfen, ob embryonale Prostaglandine nicht auch eine Rolle bei der initialen embryonalen Erkennung durch die Mutter spielen.

Das Endometrium reagiert unterschiedlich auf klonierte gegenüber in vitro fertilisierten Embryonen
The endometrium responds differently to cloned versus fertilized embryos
Bauersachs, S.; Ulbrich, S.E.; Zakhartchenko, V.; Minten, M.; Reichenbach, M.; Reichenbach, H.-D.; Blum, H.; Spencer, T.E.; Wolf, E.:
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106 (2009) 5681-5686
Untersuchungen am Tiermodell Rind konnten zeigen, dass eine modifizierte Modulation der Gen- und Proteinexpression des Endometriums bei Anwesenheit eines Embryos erfolgt, wenn anstelle von Embryonen aus in vitro Fertilisation somatische Kerntransferembryonen übertragen werden, von denen bekannt ist, dass gehäuft nach der Implantation Plazentationsanomalien mit negativen Auswirkungen auf die spätere Fötusentwicklung auftreten. Bereits in der frühen Gravidität finden also embryo-maternale Interaktionen statt, die sowohl für die frühe embryonale Entwicklung selbst als auch für den späteren Schwangerschaftsverlauf von Bedeutung sein können. Durch seine hohe Adaptionsfähigkeit zeigt das Endometrium bereits vor der Implantation die physiologische bzw. pathologische Entwicklung des Embryos an.

Regulatorische Veränderung von apoptotischen Faktoren im bovinen Corpus Luteum nach induzierter Luteolyse
Regulatory changes of apoptotic factors in the bovine corpus luteum after induced luteolysis
Kliem, H.; Berisha, B.; Meyer, H.H.D.; Schams, D.:
Molecular Reproduction & Development 76 (2009) 220-230
Ziel der Studie war es zu untersuchen, ob und wann es bei der Luteolyse des bovinen Corpus Luteum (CL) zur Apoptose der Luteal- und Endothelzellen kommt. Hierfür wurde die mRNA Expression von verschiedenen Faktoren des extrinsischen und intrinsischen apoptotischen Weges sowie der Caspasen-3, -6, -7, Monozyten chemoattraktive Protein-1 (MCP-1) und Interferone gamma (IFNgamma) untersucht. Die Luteolyse wurde durch die Gabe von 500?g Cloprostenol während der Midlutealphase induziert. Die CLs wurden 0.5, 2, 4, 12, 24, 48 und 64 h nach PGF2alpha Gabe durch transvaginale Ovarektomie entnommen. CL am Zyklustag 8-12 vom Schlachthof wurden als Kontrolle genutzt. Die mRNA Expression wurde mittels real-time RT-PCR gemessen. Außerdem wurden mit Western Blot und ELISA die Poly-(ADP-ribose)-Polymerase (PARP-1), IFNalpha und Tumor Nekrosis Fraktor alpha (TNFalpha) untersucht. Es zeigte sich, dass die mRNA Expression von MCP-1, IFNalpha und der meisten Faktoren des extrinsischen Weges signifikant zwischen 0.5 und 2 h aufreguliert waren. Die Expressionen der Faktoren des intrinsischen Weges waren erst später zwischen 24 und 48 h signifikant erhöht. Die Caspasen-6 und -3 zeigten einen signifikanten Anstieg nach 2 und 12 h, während die Caspase-7 erst nach 24 h signifikant aufreguliert war. Die Proteinmenge von TNFgamma erreichte ein signifikantes Maximum nach 12 h. Zu der Zeit konnte auch ein 89kD Fragment von PARP-1 nachgewiesen werden, das spezifisch für apoptotische Vorgänge ist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der extrinsische Weg für den Beginn der Luteolyse wichtiger ist als der intrinsische Weg, da es zu einem früheren Zeitpunkt zu einer höheren Aufregulierung der extrinsischen Faktoren kommt.

Expression und Lokalisation der Gap Junction Connexine 26 und 43 in bovinen periovulativen Follikeln und im Corpus luteum während verschiedener funktionaler Stadien während Brunstzyklus und Gravidität
Expression and localization of gap junctional connexins 26 and 43 in bovine periovulatory follicles and in corpus luteum during different functional stages of oestrous cycle and pregnancy
Berisha, B.; Bridger, P.; Toth, A.; Kliem, H.; Meyer, H.H.D.; Schams, D.; Pfarrer, C.: Reproduction in Domestic Animals 44 (2009) 295-302
Das Ziel dieser Arbeit war es die Regulation der Connexine (Cx26 und Cx43) im bovinen Ovar zu charakterisieren. Experiment 1: Ovarien mit präovulatorischen Follikeln oder Corpora lutea (CL) wurden 0, 4, 10, 20, 25 h (Follikel) und 60 h (CL) nach Injektion von GnRH gesammelt. Experiment 2: CL wurden in folgende Stadien eingeteilt: Tage 1-2, 3-4, 5-7, 8-12, 13-16, >18 (nach Regression) des Brunstzyklus und in frühe und späte Trächtigkeit (<4 and >4 Monate). Experiment 3: induzierte Luteolyse. Den Kühen wurde an den Zyklustagen 8-12 ein PGF2alpha Analog (Cloprostenol) injiziert und die CL mittels transvaginaler Ovariektomie vor und nach 0,5, 2, 4, 12, 24, 48 und 64 h nach PGF2alpha entnommen. Um die mRNA Expression zu bestimmen wurde real-time RT-PCR verwendet und um die Proteinlokalisation festzustellen Immunfluoreszenz. Die erzielten Ergebnisse deuten darauf hin, dass Cx26 und Cx43 an den lokalen zellulären Mechanismen involviert sind. Sie sind am Gewebeumbau während der kritischen Zeit um die Ovulation sowie an der CL-Bildung (Angiogenese), -Funktion und -Regression beteiligt.

Wachstumsfaktoren in porcinen antralen Follikeln während der Endreifung
Expression and possible role of fibroblast growth factor family members in porcine antral follicles during final maturation
Schams, D; Steinberg, V.; Steffl, M.; Meyer, H.H.D.; Berisha, B.:
Reproduction 138 (2009) 141-149
Das Ziel dieser Arbeit war die mögliche Beteilung von Mitgliedern der Fibroblasten Wachstumsfaktoren Familie (FGF1, FGF2 and FGF7 und ihre Rezeptoren) in porcinen Follikeln unter besonderer Berücksichtigung von FGF2 während des finalen Wachstums zu untersuchen. Die Klassifizierung der Follikel erfolgte anhand Größe und Gehalt an Östradiol-17beta, Progesteron und PGF2alpha in der Follikelflüssigkeit. Die mRNA Expression wurde mittels RT-PCR, die Hormonkonzentrationen mittels ELISA und die Proteincharakterisierung und -Lokalisierung mittels Western Blot und Immunhistochemie ermittelt. Follikelgewebe, aufgeteilt in Theka interna und Granulosazellen, wurde extrahiert und auf die mRNA von FGF1, FGF2, FGF7 und die Rezeptoren FGFR1IIIc, FGFRIIIb and FGFR2IIIc hin untersucht. Zusätzlich wurde die Expression von FSHR, LHR und Aromatase Cytochrome P450 analysiert, um die Follikel weiter zu charakterisieren. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse darauf hin, dass FGF2 im porcinen Ovar aufgrund seiner Lokalisation und Konzentration im Stroma für die Angiogense weiterer Follikel wichtig sein könnte (polyovulatorische Spezies) und nicht für die eines einzelnen Follikels wie bei Kühen.

Biochemie des Ovars unter besonderer Berücksichtigung der Angiogenese
Biochemistry of the ovary under special consideration of angiogenesis
Schams D.; Berisha, B.:
Journal of Reproductive Medicine and Endocrinology (Sonderheft 1) 6 (2009) 32-34
Der ovarielle Zyklus ist charakterisiert durch sich wiederholende regulatorische Vorgänge der Zellproliferation, Zelldifferenzierung und Transformation während der Follikelendreifung, Ovulation, Gelbkörper-Anbildung, -Funktion und -Regression. Die Angiogenese (Entwicklung von neuen Kapillaren aus bereits bestehenden durch Endothelzellen-Proliferation und -Migration) spielt hierbei eine zentrale Rolle. Die Angiogenese bedarf der integrierten komplexen Regulation von proteolytischen Enzymen (Auflösung von Basalmembranen), extrazellulären Matrixkomponeten (Fibronectin, Laminin u. a.) sowie der Regulation von angiogenen Stimulatoren (Wachstumsfaktoren) und Inhibitoren. Für die Regulation sind der Vasoendothel Wachstumsfaktor (VEGF A) sowie der Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 besonders wichtig. Angiopoietin 1 und 2 stabilisieren bzw. destabilisieren die Kapillaren. Die genaue Kenntnis der physiologischen Angiogeneseregulation ist essenzielle Voraussetzung für die Behandlung ovarieller Dysfunktionen und Tumorentwicklungen.

Die Expression von Apelin und seines Rezeptors APJ während verschiedener physiologischer Stadien des bovinen Ovars
The expression of apelin and its receptor APJ during different physiological stages in the bovine ovary
Schilffarth, S.; Antoni, B.; Schams, D.; Meyer, H.H.D.; Berisha, B.:
International Journal of Biological Sciences 5 (2009) 344-350
Studien deuten darauf hin, dass Apelin und sein Rezeptor APJ eine wichtige Rolle bei der Modulation der Angiogenese spielen könnten. Das Ziel dieser Arbeit war es daher die Regulation des Apelin/APJ Systems im bovinen Ovar näher zu charakterisieren. Experiment 1: Corpora lutea (CL) wurden in folgende Stadien eingeteilt: Tage 1-2, 3-4, 5-7, 8-12, 13-16, >18 (nach Regression) des Brunstzyklus und Monate <3, 3-5, 6-7 und >8 der Trächtigkeit. Experiment 2: Follikel während der Endreifung wurden in Granulosazellen (GC) und Theka interna (TI) aufgeteilt und getrennt von einander untersucht. Ihre Klassifizierung erfolgte nach Follikelgröße und Gehalt an Östradiol-17beta (E2) in der Follikelflüssigkeit (FF) (<0,5 ng/ml, 0,5-5 ng/ml; 5-40 ng/ml; 40-180 ng/ml; >180 ng/ml). Es wurde die qRT-PCR angewendet, um die mRNA Expression der untersuchten Faktoren zu bestimmen. Die Ergebnisse lassen darauf schließen, dass das Apelin/APJ System in die Mechanismen, die die Angiogenese während der Follikelendreifung und der CL-Anbildung und -Funktion beim Rind erzeugt, involviert sein könnte.

III. Lebensmittel, Ernährung, Umwelt

1) Futtermittel

Die immun-modulatorische Wirkung von Lactulose und Enterococcus faecium auf die Darmgesundheit in Kälbern
The immunomodulatory effect of lactulose on Enterococcus faecium fed preruminant calves
Fleige, S.; Preißinger, W.; Meyer, H.H.D.; Pfaffl, M.W.:
Journal of Animal Science 87 (2009) 1731-1738
Durch die Fütterung kann die Kompetenz des Immunsystems beeinflusst und somit auch die Pathogenese von Erkrankungen erheblich moduliert werden. Im Mittelpunkt dieser Arbeit stehen die synbiotische und darmstabilisierende Wirkung von Lactulose und Enterococcus faecium in verschiedenen immunrelevanten Geweben im Kälberdarm.
Die Verabreichung von Lactulose hat als vorrangiges Ziel die Wachstumsförderung der probiotischen Bakterien und somit die Herstellung einer gesunden Eubiose im Darm, während deren Stoffwechselprodukte den pH-Wert reduzieren und die Milieubedingungen für die proteolytische Flora negativ beeinflussen. Zahlreiche Befunde lassen vermuten, dass die durch Prebiotika geförderten Bifidobakterien die Bildung von spezifischen und unspezifischen Antikörpern sowie Zytokinen, zellulär vermittelten Immunitätsexpressionen und die Erhöhung der unspezifischen Abwehr massiv fördern. Auch Verbesserung der Leistungsparameter können durch die Fütterung von Pre- und Probiotika erzielt werden.
Um die Wirkung von Lactulose auf die genannten Parameter zu untersuchen, wurden in einem Fütterungsversuch 42 Kälber in drei homogene Gruppen zu je 14 Tiere eingeteilt. Die Kontrollgruppe (L0) wurde mit einem Milchaustauscher gefüttert, der 109 KBE Enterococcus faecium enthielt. Den Behandlungsgruppen L1 und L3 wurden zusätzlich 1% bzw. 3% TS Lactulose im Austausch gegen Milchpulver verabreicht. Es wurden das große Blutbild sowie die Populationen der Blutkörperchen untersucht. Als einziger Befund konnten signifikant mehr Lymphozyten in der L3 Gruppe gefunden werden. Im Weiteren wurden Genexpressionsanalysen der wichtigsten pro- und anti-inflammatorischen Zytokine sowie Oberflächenmarker (CD 4, CD 8, CD 25, CD 69 und CD 89) in den zirkulierenden Blutzellen mittels real-time qRT-PCR quantifiziert.
Anti-inflammatorische Zytokine wie IL-10 und TGF-ß1 wurden in unterschiedlichen Darmkompartimenten erhöht exprimiert. Weiterhin wurde durch Expressionsanalysen ein Anstieg der IgA Rezeptorexpression (IgA FcR, CD 89) und die Abnahme der IFN? Expression im Ileum männlicher Kälber der Behandlungsgruppe L3 festgestellt. Bei weiblichen Kälbern wurden die CD4+ Lymphozyten im Ileum und im mesenterialen Lymphknoten runterreguliert, währenddessen die CD8+ Lymphozyten im Blut aufreguliert wurden. Durch diese Ergebnisse wird deutlich, dass Lactulose das Potenzial zur Immunmodulation hat. Pro- und anti-inflammatorischen Zytokine, wie IL-1ß, Il-8, TNFalpha und TGF-ß1, sowie die Lymphozyten Aktivierungsmarker CD 25 und CD 69 zeigten keine signifikanten Veränderungen zwischen den Behandlungsgruppen.
Lactulose konnte das Immunsystems modulieren und hat positive Wirkungen auf das Darmschleimhautimmunsystems. Somit kann man behaupten, Laktulose hat die Kompetenz die Darmgesundheit zu fördern. Die Wirkung wird im wesentlichen der Verschiebung der T-Zell Subpopulationen und dem transzellulären Transport von IgA mittels dem IgA FcR Rezeptor (CD 89), und weniger den Veränderungen der pro und anti-inflammatorischen Zytokinen zugeschrieben.

Auswirkung von Pinienpollenextrakten auf Ausbreitung und mRNA Expression auf ileale Zellkulturen
Effects of pine pollen extracts on the proliferation and mRNA expression of porcine ileal cell cultures
Masanetz, S.; Kaufmann, C.; Letzel, T.; Pfaffl, M.W.:
Journal of Applied Botany and Food Quality 83 (2009) 14-18
Pollen von Pinus massoniana, der chinesischen Gelbkiefer, werden in der traditionellen chinesischen Medizin schon seit Jahrhunderten zur Erhaltung der Gesundheit eingesetzt. Auch zur direkten Behandlung von Krankheiten, wie etwa chronischer Obstipation, Leberleiden oder Hauterkrankungen werden diese Pollen verwendet. Bislang existierten hauptsächlich empirische Erfahrungen über die Wirksamkeit dieses Heilmittels der chinesischen Medizin. Erst seit relativ kurzer Zeit wird auch versucht, dieser Heilwirkung in wissenschaftlichen Studien auf den Grund zu gehen. So fand man z.B., dass Pinienpollen nur wenig metabolisierbare Energie enthalten, dafür aber sehr viele unverdauliche Zellwandbestandteile. Zusätzlich wurde auch ein breites Spektrum sekundärer Pflanzenmetaboliten, wie etwa polyphenolische Substanzen, entdeckt. In Fütterungsstudien wurden typischerweise von Präbiotika bekannte Wirkungsweisen gefunden. So führten Pinienpollen z.B. zu einer vermehrten Fäzesbildung mit höherem Feuchtigkeitsanteil bei Ratten oder hatten Auswirkungen auf die täglichen Zunahmen, den pH-Wert des Darminhaltes und den Aufbau der Darmmucosa beim Ferkel. Außerdem wurden im Ferkel auch Änderungen der Expression verschiedener Gene im Zusammenhang mit Proliferation, Inflammation und der Apoptose gefunden. In Versuchen mit Pollenextrakten der zu P. massoniana verwandten P. densiflora wurden bei Ratten mildernde Auswirkungen auf das Entzündungsgeschehen nach verschiedenen Reizen gefunden. Im Zellkulturexperiment entdeckte man dabei auch starke anti-oxidative Wirkungen der Extrakte, die auf den Gehalt an Flavonoiden zurückgeführt wurden.
Diese Fakten wurden zum Anlass genommen, eigene Zellkulturexperimente mit P. massoniana-Pollenextrakten und einer porcinen ilealen Epithelzelllinie (IPI-21) durchzuführen, um eine mögliche Wirkung, die über die bereits beschriebene präbiotische Wirkung hinausgeht, aufzuklären. Dabei wurde eine deutliche Verringerung der Zellproliferation nach der Gabe bestimmter Pollenextrakte (Wasser-, 50% Ethanol- und 100% Ethanolextrakt) gefunden. Die Menge an Polleninhaltsstoffen entsprach dabei dem Zusatz von 1% nativen Pollen zum Zellkulturmedium. Während der Genexpressionsanalyse stellte sich zudem heraus, dass die Inhaltsstoffe des 50% Ethanol-Pollenextrakts einen signifikant steigernden Einfluss auf die Expression der pro-inflammatorischen Cytokine IL6 und IL8 hatte, sowie eine senkende Wirkung auf die Expression des Proliferationsmediators Cyclin A. Extrakte, die über Hexan oder 80% Methanol gewonnen wurden, hatten keine erkennbare biologische Wirkung. Eine genauere Untersuchung der Inhaltsstoffe der einzelnen Extrakte lieferte Massensignale, die für wirksame Pollenextrakte spezifisch waren, und in den unwirksamen fehlten. Eine Identifizierung dieser Substanzen ist mit den momentan verfügbaren Mitteln jedoch leider noch nicht möglich.
Abschließend steht nun fest, dass P. massoniana-Pollen einen Einfluss auf das Zellwachstum und die Genexpression von intestinalen Epithelzellen haben können, die von einem präbiotischen Effekt unabhängig sind. Die genauen Ursachen dieser Wirkungen sowie die Relevanz in vivo müssen allerdings noch geklärt werden.

2) Gentechnisch veränderte Futtermittel

Entwicklung einer sensitiven und hochspezifischen quantitativen real-time PCR und eines ELISA für die Detektion eines potentiellen Transfers von rekombinanter DNA und des Cry1Ab Proteins aus dem Futter in die Milch
Sensitive and highly specific quantitative real-time PCR and ELISA for recording a potential transfer of novel DNA and Cry1Ab protein from feed into bovine milk
Guertler, P.; Paul, V.; Albrecht, C.; Meyer, H.H.D.:
Analytical and Bioanalytical Chemistry 393 (2009) 1629-1638
Eine hochspezifische und sensitive quantitative real-time PCR (qPCR) und ein ELISA wurden für die Kontrolle eines möglichen Übergangs von rekombinanter DNA und rekombinantem Protein in die Milch von Kühen, die mit gentechnisch verändertem Mais (MON810) gefüttert wurden, entwickelt, um den öffentlichen Bedenken bezüglich der Lebensmittelsicherheit Rechnung zu tragen. Die entwickelten Assays wurden entsprechend der EU-Richtlinie 2002/675/EC validiert. Das Detektionslimit und das Detektionsvermögen der qPCR und des ELISA lagen bei 100 Kopien der cry1Ab DNA pro ?L Milch bzw. 0.4 ng Cry1Ab Protein pro mL Milch. Die Wiederfindungraten lagen bei 84,9% (DNA) und 97% (Protein) und geringe Abweichungen (<15%) verdeutlichen die Verlässlichkeit und Genauigkeit der Messungen. Eine spezische qPCR Amplifikation und die Verwendung spezifischer Antikörper im ELISA gewährleisten eine hohe Spezifität der Assays. In 90 Milchproben von Kühen, die sechs Monate mit gentechnisch verändertem Mais (N=8) und mit nicht-gentechnisch verändertem Mais (N=7) gefüttert wurden, konnte unter Verwendung dieser Methoden weder cry1Ab DNA noch das Cry1Ab Protein innerhalb des Detektionsbereichs detektiert werden.

Was passiert mit gentechnisch verändertem Mais und konventionellem Raps nach der Aufnahme durch Wildschweine(Sus scrofa)?
Fate of genetically modified maize and conventional rapeseed, and endozoochory in wild boar (Sus scrofa)?
Wiedemann, S.; Lutz, B.; Albrecht, C.; Kuehn, R.; Killermann, B.; Einspanier, R.; Meyer, H.H.D.:
Mammalian Biology 74 (2009) 191-197
Der in den letzten Jahren zunehmende Anbau von Mais in Deutschland stellt für Wildschweine (Sus scrofa) eine energiereiche Nahrungsquelle dar. Zusätzlich werden erhebliche Mengen Mais im Rahmen der Winterfütterung, der Kirrung oder der Ablenkfütterung aufgenommen. Weltweit nimmt die Anbaufläche von gentechnisch verändertem (gv) Mais und Raps stetig zu, und auch in Deutschland wurde seit 2005 bis zunächst April 2009 gv Mais landwirtschaftlich genutzt. Die gv Mais Linien produzieren das Cry1ab Protein, ein Toxin, das gegen die Maiszünsler-Larve gerichtet ist. Dies hat zu einer heftigen Diskussion über den Verbleib von gv Bestandteilen nach der Aufnahme durch Wildtiere geführt (z.B. im Fleisch), und Fragen zur möglichen Verdauungsausbreitung von keimfähigem transgenem Saatgut (Endozoochorie) aufgeworfen. In einer Studie mit gentechnisch verändertem Mais und der nicht gentechnisch veränderten Vergleichssorte erhielten 8 Wildschweine transgenen Häcksel- und Körnermais und 6 Wildschweine isogenen Häcksel- und Körnermais. Weiterhin wurden die Tiere mit konventionellem Raps gefüttert, so dass die gruppenweise gesammelten Kotproben auf intakte und keimfähige Mais- bzw. Rapskörner untersucht werden konnten. Von allen Tieren wurden nach Beendigung des Versuchs Proben aus dem Verdauungstrakt und aus sämtlichen inneren Organen, wie Blut und Geweben, und auch aus Muskelgewebe gewonnen, und die genomische DNA und Proteine isoliert. Mittels PCR konnten kurze bis mittlere Fragmente des pflanzlichen Chloroplasten Gens rubisco in den Inhalten des Magen-Darm-Traktes insbesondere des Magens nachgewiesen werden. Das transgene cry1Ab Gen wurde nur als kleines Fragment im Verdauungstrakt gefunden, war aber in keinen Proben außerhalb des Darmtrakts nachweisbar. Die Proteinanalytik mittels ELISA ergab Signale für immunoaktives Toxin in Inhalten verschiedener Magen-Darm-Trakt Abschnitte, wohingegen der Immunoblot keine spezifischen Banden zeigte. In Geweben außerhalb des GIT war das Cry1Ab Protein nicht nachweisbar. Die Untersuchungen zur Verbreitung von keimfähigem Saatgut durch das Wildschwein ergaben, dass ca. 0,015% der isogenen und 0,009% der transgenen Maiskörner die Kau- bzw. Schluckphase sowie die Passage im Magen-Darm-Trakt unbeschädigt überstanden. Nur eine Pflanze (0,00013%) konnte unter standardisierten Laborbedingungen wachsen, ein weiterer Keimling zeigte ein abnormes Wachstum. Zusammenfassend belegen die Ergebnisse, dass im Monogastrier Wildschwein die aufgenommene pflanzliche DNA und aufgenommenes Cry1Ab Protein während der Magen-Darm-Trakt Passage sehr effektiv abgebaut wird. Die Untersuchungen zur unkontrollierten Verbreitung von Saatgut zeigten, dass Wildschweine in seltenen Fällen intakte keimfähige Maiskörner ausscheiden.

IV. Wachstumsphysiologie, myotrope Therapeutika und Anabolika

Die leistungssteigernden Eigenschaften anaboler Substanzen werden vor allem in der Tiermast und im Humansport genutzt. In der Tiermast führen diese zu Gewichtszunahme und zu einer verbesserten Futterverwertung, womit die Produktivität erhöht und Kosten gesenkt werden.
In einigen Ländern, wie den USA, Kanada, Australien, Mexiko und Südafrika ist der Gebrauch von Wachstumsförderern in der Tiermast zugelassen. Aufgrund erwiesener Nebenwirkungen für den Konsumenten ist der Gebrauch anaboler Substanzen in der EU verboten, wo die Einhaltung dieser Richtlinie (88/146/EEC) streng überwacht wird.
Um den Missbrauch anaboler Substanzen in der Tiermast oder im Sport zu kontrollieren, werden Hormonrückstände mittels Immunoassays oder chromatographischer Methoden in Kombination mit Massenspektrometrie detektiert. Mit Hilfe dieser Methoden können nur bekannte Substanzen nachgewiesen werden. Neu entwickelte Substanzen oder Kombinationen aus mehreren Substanzen können mit diesen Methoden oft nicht detektiert werden. Um eine effiziente Kontrolle des Missbrauchs anaboler Stoffe zu gewährleisten, ist es nötig neue Technologien zu entwickeln, mit denen man den Gebrauch einer breiten Masse an illegalen Medikamenten inklusive neu entwickelter Xenobiotika nachweisen kann.

Der Nutzen von „Omik“ Technologien für die Entwicklung von Biomarkern für die Aufdeckung des Missbrauchs anaboler Substanzen
The use of omic technologies for biomarker development to trace functions of anabolic agents
Riedmaier, I.; Becker, C.; Pfaffl, M.W.; Meyer, H.H.D.:
Journal of Chromatography A 1216 (2009) 8192-8199
In diesem Übersichtsartikel wurde das Potential des Nachweises physiologischer Veränderungen mit Hilfe sogenannter „Omik“ Technologien, wie Transkriptomik, Proteomik und Metabolomik für die Entwicklung eines solchen neuen Testsystems beleuchtet. Hierbei wurden verschiedene Kandidatengene, -proteine und -metaboliten gefunden, welche als potentielle Biomarker dienen könnten. In Kombination mit biostatistischen Methoden stellen diese „Omik“ Technologien potentielle Werkzeuge für die Entwicklung neuer Nachweismethoden dar.

Identifizierung potentieller Genexpressions Biomarker für den Nachweis anaboler Substanzen in bovinen Blutzellen
Identification of potential gene expression biomarkers for the surveillance of anabolic agents in bovine blood cells
Riedmaier, I.; Tichopad, A.; Reiter, M.; Pfaffl, M.W.; Meyer, H.H.D.:
Analytica Chimica Acta  638 (2009) 106-113
In einem Versuch mit Nguni Färsen wurde der Einfluss von einer Kombination aus den anabolen Steroiden Trenbolon Acetat plus Estradiol auf die Genexpression in bovinen Blutzellen untersucht. Hierfür wurden 9 Tiere über 39 Tage mit dieser Kombination behandelt. 9 weitere Tiere dienten als unbehandelte Kontrolltiere. Blutproben wurden an verschiedenen Tagen der Behandlung gezogen (vor Behandlungsbeginn, Tag 2, 16 und 39 der Behandlung). Unterschiede in der Genexpression verschiedener Kandidatengenen zwischen den beiden Behandlungsgruppen wurden mit Hilfe von RT-qPCR bestimmt. Unterschiede wurden dabei in der Expression der Steroidrezeptoren ERalpha und ERbeta, des Apoptoseregulators Fas, der proinflammatorischen Interleukine IL-1alpha, IL-1beta, und IL-6 und von MHCII, CK, MTPN, RBM5 und Actin-beta gefunden. Mit Hilfe der Principal Components Analyse (PCA) konnte unter Einbeziehung der signifikant regulierten Gene eine Trennung der beiden Behandlungsgruppen beobachtet werden.

Der Einfluss von Testosteron und einem neuen SARM auf die Genexpression in Vollblut bei Macaca fascicularis
Influence of testosterone and a novel SARM on gene expression in whole blood of Macaca fascicularis
Riedmaier, I.; Tichopad, A.; Reiter, M.; Pfaffl, M.W.; Meyer, H.H.D.:
Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology 114 (2009) 167-173
Ein Anwendungsgebiet anaboler Steroidhormone in der Therapie ist die Behandlung altersbedingter Krankheiten wie Osteoporose oder Sarkopenie, welche durch eine Abnahme der endogenen Produktion von Östradiol und Testosteron bei rückläufiger Gonadenfunktion verursacht werden. Für die Behandlung dieser altersbedingten Krankheiten wurden sogenannte selektive Androgen Rezeptor Modulatoren (SARM) entwickelt. Darunter versteht man synthetische Moleküle, welche die nützlichen zentralen und peripheren Eigenschaften von Testosteron besitzen, jedoch kaum Nebenwirkungen aufweisen. In Kooperation mit TAP Pharmaceuticals Inc., Lake Forest, USA, und Covance, Münster, wurde ein Versuch an Macaca fascicularis durchgeführt, bei welchem der Einfluss eines neuen SARM auf die Genexpression im Vollblut mit dem natürlichen Testosteron verglichen wurde. Dabei wurden signifikant regulierte Gene aus den Gruppen der Apoptoseregulatoren (Fas, TNFR1, TNFR2, CD30L) und der Interleukine (IL-12B, IL-15) identifiziert. Mit Hilfe der Principal Components Analyse (PCA) konnte unter Einbeziehung der signifikant regulierten Gene eine Trennung der einzelnen Behandlungsgruppen beobachtet werden.

Genexpression in Papillazellen aus dem Haarfollikel nach Behandlung mit Stanozolol
Gene Expression in hair follicle dermal papilla cells after treatment with Stanozolol
Reiter, M.; Pfaffl, M.W.; Schönfelder, M.; Meyer, H.H.D.: Biomarkers Insight 4 (2009) 1-8
Es ist bekannt, dass anabole Substanzen über längere Zeit in Haaren nachzuweisen sind, weshalb zu Rückstandsanalysen innerhalb der Dopingkontrollen im Sport neben Urin und Blut auch Haare hinzugezogen werden. In dieser Pilotstudie sollte getestet werden, ob es durch anabole Substanzen zu Veränderungen im Genexpressionsmuster in Haarfollikelzellen kommt, die als potentielle Biomarker in der Dopinganalyse dienen könnten.
Hierfür wurde eine Zellkultur aus Papillazellen des Haarfollikels eines männlichen und eines weiblichen Spenders mit Stanozolol – einem anabolen Androgen, das oft als Dopingmittel verwendet wird – in verschiedenen Konzentrationen behandelt. Diese Zellen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Behandlung entnommen, und die Expression verschiedener Kandidatengene wurde mittels der RT-qPCR bestimmt.
In den Zellen des weiblichen Spenders konnte eine signifikante Regulation des Androgen Rezeptors, des Fas Rezeptors und von FGF2 festgestellt werden. In den Zellen des männlichen Spenders waren der Androgen Rezeptor, der Fas Rezeptor und SRD5A2 signifikant reguliert. Diese Pilotstudie zeigt, dass es möglich ist Genexpressionsunterschiede, verursacht durch Stanozolol in Haarfollikelzellen, zu identifizieren, die als mögliche Biomarker für die Dopinganalyse in Frage kommen.

Nachweisbarkeit von Testosteron Estern und Estradiol Benzoat nach pour-on Behandlung in bovinen Haaren und Plasma
Detectability of testosterone esters and estradiol benzoate in bovine hair and plasma following pour-on treatment
Stolker, A.A.M. ; Groot, M.J.; Lasaroms, J.J.P.; Nijrolder, A.W.J.M.; Blokland, M.H.; Riedmaier, I.; Becker, C.; Meyer, H.H.D.; Nielen, M.W.F.:
Analytical and Bioanalytical Chemistry 395 (2009) 1075-1087
In Kooperation mit dem RIKILT Institute of Food Safety, Wageningen, Niederlande, wurde am Veitshof in Freising eine Kälberstudie durchgeführt, bei der den Tieren ein Hormoncocktail aus Testosteron-Cypionat, Testosteron-Decanoat und Estradiol-Benzoat via pour on (über die Haut) appliziert wurde. Dabei sollte die Nachweisbarkeit der Hormonester in Blut und Haaren in Abhängigkeit vom Trägermaterial, der wiederholten Applikation und dem Zeitabstand zwischen der letzten Applikation und der Probennahme getestet werden.
Die Hormonester konnten in den Haaren nach einmaliger Behandlung noch 5-7 Wochen nach der Behandlung nachgewiesen werden. Nach dreimalig wiederholter Behandlung im wöchentlichen Abstand konnten die Hormonester noch 9-11 Wochen nach der letzten Applikation in den Haaren detektiert werden. Im Blut konnten hingegen keine Rückstände der applizierten Hormonester nachgewiesen werden, was darauf hinweist, dass die Hormonester bei pour on Behandlung schon vor dem Eintritt in den Blutkreislauf hydrolisiert und epimerisiert werden.

V. Wildtierbiologie

Testosteron, aber nicht IGF-1, LH, Prolaktin oder Cortisol, scheint das wichtigste Geweihwachstum stimulierende Hormon bei Rothirschen zu sein (Cervus elaphus)
Testosterone, but not IGF-1, prolactin or cortisol, may serve as antler-stimulating hormone in red deer stags (Cervus elaphus)
Bartos, L.; Schams, D.; Bubenik, G.A.:
Bone 44 (2009) 691-698
Für die Stimulierung des Geweihwachstums bei Rothirschen werden vor allem Androgene und Insulin ähnlicher Wachstumsfaktor 1 (IGF-1) diskutiert. In einem Versuch mit 8 zwei Jahre alten sowie 12 erwachsenen Rothirschen wurden Blutproben über den gesamten Zeitraum des Geweihwachstums gesammelt und auf die Hormone Testosteron, Cortisol, IGF-1, Luteinisierungshormon und Prolaktin untersucht. Das Geweihwachstum pro Tag zeigte die beste Korrelation mit den Bluttestosteronkonzentrationen in beiden Gruppen. Nur bei den zwei Jahre alten Hirschen konnte eine gewisse Korrelation mit IGF-1 nachgewiesen werden. Trotzdem war nur ein Zusammenhang mit Testosteron ersichtlich. Bezüglich der Gesamtdauer des Geweihwachstums bei erwachsenen Hirschen im Vergleich zu den zweijährigen war nur die Konzentration von Testosteron und LH signifikant höher. Aufgrund der Ergebnisse wird geschlossen, dass nicht IGF-1 sondern Testosteron verantwortlich für die Intensität des Geweihwachstums bei jüngeren und älteren Hirschen ist.

 

 

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    Letzte Änderung: 29.10.2015