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Forschungsaktivitäten 2010:

I.    Laktationsphysiologie

II.   Reproduktionsbiologie

III.  Lebensmittelsicherheit, Ernährung und UmweltIV. Wachstumsphysiologie, myotrope Therapeutika und Anabolika

IV.  Wachstumsphysiologie, myotrope Therapeutika und AnabolikaV. Wildtierbiologie

V.   Wildtierbiologie

VI.  Bioanalytik

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I. Laktationsphysiologie

Analyse des Metaboloms von Milchkühen in der Früh- und Spätlaktation basierend auf Kernspinresonanzspektroskopie und Massenspektrometrie
Nuclear magnetic resonance and mass spectrometry-based milk metabolomics in dairy cows during early and late lactation
Klein, M.S.1; Almstetter, M.F.1; Schlamberger, G.; Nürnberger, N.1; Dettmer, K.1; Oefner, P.J.1; Meyer, H.H.D.; Wiedemann, S.; Gronwald, W.2: Journal of Dairy Science 93 (2010) 1539-1550
In dieser Studie wurde eine Reihe von Metaboliten in der Milch von Kühen in der Frühlaktation und solchen in der Spätlaktation gemessen. Es wurden solche Metaboliten betrachtet, die im Zusammenhang mit dem Energiestoffwechsel stehen. Dabei war das Ziel der Studie zu prüfen, ob es Korrelationen gibt zwischen der metabolischen Situation der Kuh und einzelnen Metaboliten in der Milch. Diese Metaboliten sollten ihrer Aussagekraft entsprechend identifiziert werden. Die Proben stammten von Tieren der Rasse Brown Swiss (9200 kg, n = 58) und der Rasse Fleckvieh (8300 kg, n = 48). Von jeder Rasse standen Proben aus der Frühlaktation, der Mitte der Laktation und der Spätlaktation zur Verfügung. Mittels Kernspinresonanzspektroskopie (nuclear magnetic resonance spectroscopy NMR) und Gas-Chromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie (gas chromatography-mass spectrometry GC-MS) konnten 44 Metaboliten in der Milch erfasst werden. Die Ergebnisse zeigen für verschiedene Biomarker des Energiestoffwechsels wie Aceton und ?-Hydroxybutyrat eine deutliche Korrelation zum Stoffwechselstatus der Kühe (r = 0,69, P < 0,05), besonders in der Frühlaktation. Die Korrelationen zwischen der ?-amino-Buttersäure (bekannt auch beim Menschen im Hungerzustand) und Glycin wurden hier besonders bei den Tieren mit der sehr hohen Milchleistung gefunden (r = 0,66, P < 0,05).

Effekte kontinuierlichen Melkens während der Trockenphase oder des einmal täglichen Melkens in den ersten 4 Wochen der Laktation auf den Metabolismus und die Produktivität von Milchkühen
Effects of continuous milking during the dry period or once daily milking in the first 4 weeks of lactation on metabolism and productivity or dairy cows
Schlamberger, G.; Wiedemann, S.; Viturro, E.; Meyer, H.H.D.; Kaske, M.3: Journal of Dairy Science 93 (2010) 2471-2485
Ziel dieser Arbeit war, die Effekte von drei Melkregimen auf das metabolische Profil sowie auf die Milchproduktion zu vergleichen. 32 Braunviehkühe wurden aleatorisch den  Behandlungsgruppen (n = 12 Kühe / Gruppe) zugeteilt: 1. Kontrollgruppe (C), mit 56 Tagen Trockenphase vor der Kalbung und zweimal täglichem Melken während der Laktation; 2. ODM-Gruppe, in der die Kühe nur einmal täglich in den ersten 4 Wochen der Laktation gemolken wurden; und 3. die CM-Gruppe, in der die Kühe keine Trockenphase vor der Kalbung hatten. Die Blutglukosekonzentration sank zwischen Woche 1 und 4 ausschließlich in der Gruppe C. Serumkonzentrationen von NEFA und BHBA waren in den ersten 4 Wochen der Laktation im Vergleich mit der ODM- sowie der CM-Gruppe signifikant erhöht. In Gruppe C war eine verminderte Rückenfettdicke  während der frühen Laktation und eine Abnahme des Body Condition Scores deutlich stärker ausgeprägt als bei den Kühen der ODM- sowie der CM-Gruppe. Die Milchleistung war in der Kontrollgruppe (11.310 ± 601 kg/305 Tage) um 16% höher im Vergleich mit der ODM- (9,531 ± 477 kg/305 Tage) sowie der CM-Gruppe  (9,447 ± 310 kg /305 Tage). Der Eiweißanteil war jedoch in der CM-Gruppe (3.91%) im Vergleich mit der Kontrollgruppe (3.52%) deutlich erhöht.

Eine schnelle Methode zur Analyse von Cholesterin in boviner Milch und Möglichkeiten ihrer Anwendung
Rapid method for cholesterol analysis in bovine milk and options for applications
Viturro, E.; Meyer, H.H.D.; Gissel, C.4; Kaske, M.3: Journal of Dairy Research 77 (2010) 85-89
Untersucht wurde die Anpassung einer kolorimetrischen Technik für die Analyse von Cholesterin in Rohmilch.  Im Gegensatz zu chromatographischen Verfahren erlaubt diese Technik eine schnelle und günstige Messung dieses Metabolits in Milchproben, ohne die für wissenschaftliche Zwecke gewünschte Präzision zu verlieren. Ein Intra-Assay- und Inter-Assay-Variationskoeffizient (CV) von 4.8% und 9.1% wurden gemessen.
Die Wiederfindung zugesetzten Cholesterins war auch befriedigend günstige Messung dieses Metabolits in Milchproben, ohne die für wissenschaftliche Zwecke gewünschte Präzision zu verlieren. Ein Intra-Assay- und Inter-Assay-Variationskoeffizient (CV) von 4.8% und 9.1% wurden gemessen. Die Wiederfindung zugesetzten Cholesterins war auch befriedigend (98.1 bis 106.3%). Allerdings muss die Milchfettextraktion innerhalb von 48 Stunden nach der Probenentnahme durchgeführt werden und die Variation von Fett sowie des Cholesterinwertes innerhalb des Melkens muss berücksichtigt werden.

Supplementierung der Ration von Milchkühen mit Pansen geschützten konjugierten Linolsäuren während der Spätträchtigkeit und Frühlaktation: Effekte auf Milchinhaltsstoffe, Milchmenge, Blutmetaboliten und die Genexpression in Lebergewebe
Rumen-protected conjugated linoleic acid supplementation to dairy cows in late pregnancy and early lactation: effects on milk composition, milk yield, blood metabolites and gene expression in liver
Sigl, T.; Schlamberger, G.; Kienberger, H.5; Wiedemann, S.; Meyer, H.H.D.; Kaske, M.3: Acta Veterinaria Scandinavica 52 (2010) 16
Konjugierte Linolsäuren sind ungesättigte Fettsäuren mit 18 Kohlenstoffatomen, die mehrere Doppelbindungen zwischen den Kohlenstoffatomen der Kette haben. Das Ziel der Studie war es, die Effekte auf Milchinhaltsstoffe und metabolische Schlüsselparameter, durch die CLA-Ergänzung der Ration von Milchkühen in den ersten vier Laktationswochen, zu untersuchen.
An fünf erstkalbige Braunviehkühe wurde, beginnend zwei Wochen vor der erwarteten Kalbung, täglich 7,5 g CLA (50 % c9,t11- und 50 % t10,c12-CLA) und anschließend während der ersten vier Laktationswochen täglich jeweils 20 g CLA (50 % c9,t11- und 50 % t10,c12-CLA) verfüttert. Weitere fünf erstkalbige Braunviehkühe erhielten eine CLA freie Ration und dienten als Kontrollgruppe.
Das CLA-Supplement wurde von den Milchkühen nur unzureichend akzeptiert: nur etwa 61,5 % der vorgelegten Menge wurden von den Tieren aufgenommen. Die verfütterten CLA waren im Milchfett der Tiere, die die CLA supplementierte Ration erhielten, nachweisbar. Der Gehalt an c9,t11- und t10,c12-CLA im Milchfett war bei der CLA-Gruppe im Vergleich zu der Kontrollgruppe höher. Im Durchschnitt konnte während des kompletten Behandlungszeitraumes ein Abfall der gesättigten Fettsäuren sowie ein höherer Gehalt an einfach ungesättigten und trans-Fettsäuren im Milchfett der CLA supplementierten Kühe ermittelt werden.
In unserer Studie konnten keine signifikanten Ergebnisse durch die Verfütterung von c9,t11- und t10,c12-CLA auf die Milchmenge und die Milchinhaltsstoffe sowie auf metabolische Schlüsselparameter im Blut nachgewiesen werden. Außerdem waren durch die CLA-Supplementierung keine signifikanten Effekte auf die Genexpression von PPAR?, PPAR?, SREBP-1 und TNF? im Lebergewebe erkennbar.
Die Verfütterung von c9,t11- und t10,c12-CLA in den ersten vier Wochen nach der Kalbung hatte keine Auswirkungen auf die metabolischen Schlüsselparameter im Blut und die Milchinhaltsstoffe der frischabkalbenden Kühe. Die Milchfettzusammensetzung veränderte sich hinsichtlich eines höheren Gehaltes an c9,t11- und t10,c12-CLA im Milchfett. Das vermehrte Vorkommen von langkettigen Fettsäuren im  Milchfett der CLA supplementierten Kühe deutete darauf hin, dass die massive peripherale Lipomobilisation während der Frühlaktation durch die Verfütterung von CLA nicht beeinflusst war.

II. Reproduktionsbiologie

Wirkung von Prostaglandin F2 alpha auf lokale luteotrope und angiogene Faktoren während der induzierten funktionellen Luteolyse im Rinder Gelbkörper
Effect of prostaglandin F2 alpha on local luteotropic and angiogenic factors during induced functional luteolysis in the bovine corpus luteum
Berisha, B.; Meyer, H.H.D.; Schams, D.: Biology of Reproduction 82 (2010) 940-947
Die essentielle Bedeutung von Prostaglandin F2 alpha (PDGF) für die Induktion der Luteolyse ist klar bewiesen. Jedoch sind die Folgeeffekte auf lokale luteotrope Faktoren (Oxytocin, OXT) und sein Rezeptor, Insulin ähnlicher Wachstumsfaktor (IGF1), Progesteron (P) und sein Rezeptor (PR), Vasoendothel Wachstumsfaktor A (VEGF) und der Kapillar-Destabilisierungsfaktor Angiopoietin 2 (ANGPT) zeitabhängig nicht klar definiert. Ziel der Untersuchungen war es, die Gewebekonzentrationen dieser Faktoren zu erfassen nach induzierter Luteolyse mit PDGF (Tag 8 – 12). Neben Gewebekonzentrationen (EIA, RIA) wurde auch die mRNA Expression mittels RT-PCR erfasst. Gelbkörper (CL) n = 5/Gruppe wurden vor (0 h) sowie 0,5, 2, 4, 12, 24, 48 und 64 h nach der PDGF Injektion durch transvaginale Ovariektomie gewonnen.
Protein Konzentrationen fielen zwischen 0,5 und 2 h signifikant ab. Die mRNA war bis 12 h signifikant runterreguliert. ANGPT 2 war dagegen für mRNA und Protein bis 2 h signifikant hochreguliert und fiel nach 4 h stark. Dagegen stieg die IGF1BP1 mRNA ab 2 h kontinuierlich an.
Der akute Abfall von luteotropen Faktoren sowie akute Veränderungen von ANGPT 2 und VEGF A lassen vermuten, dass die Modulation der vaskulären Stabilität eine Schlüsselfunktion hat innerhalb der Kaskade von Regulationen die zur funktionalen Luteolyse führen.

Adrenomedullin Signalling im Gelbkörper des Rindes während Brunstzyklus, Gravidität und Luteolyse
Adrenomedullin signalling in bovine corpus luteum during oestrous cycle, gravidity and induced luteolysis
Schilffarth S., Berisha B.: Albanian Journal of Agricultural Sciences 2 (2010): 9-17
Untersuchungen zu "nichtklassischen" Regulatoren der Angiogenese könnten neue Perspektiven für das Verständnis der Angiogenese unter physiologischen und pathologischen Bedingungen öffnen. Das Ziel dieser Arbeit war es die mRNA-Expression von Adrenomedullin (AM), Co-Faktor-Aktivitäts-modifizierendes Protein 2 (RAMP-2) und Calcitonin-Rezeptor-ähnliches-Rezeptor (CALCLR) im bovinen Gelbkörper (CL) während  verschiedenen physiologischen Stadien zu charakterisieren. Experiment 1: CL wurden in folgende Stadien eingeteilt: Tage 1-2, 3-4, 5-7, 8-12, 13-16, >18 (nach Regression) des Brunstzyklus und in frühe und späte Trächtigkeit (<4 and >4 Monate). Experiment 2: induzierte Luteolyse. Den Kühen wurde an den Zyklustagen 8-12 ein PGF2alpha Analog (Cloprostenol) injiziert und die CL mittels transvaginaler Ovariektomie vor und nach 0,5, 2, 4, 12, 24, 48 und 64 h nach PGF2alpha entnommen. Es wurde die real-time RT-PCR angewendet, um die mRNA Expression der untersuchten Faktoren zu bestimmen. Die Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die untersuchten Faktoren in die Mechanismen der CL- Funktion, insbesondere während der letzten Monate der Gravidität, involviert sein könnten.

Induzierung der Endothelin 2 Expression durch das Luteinisierungshormon und Hypoxie
Induction of endothelin-2 expression by luteinizing hormone and hypoxia: Possible role in bovine corpus luteum formation
Klipper, E.11; Levit, A.11; Mastich, Y.11; Berisha, B.; Schams, D.; Meidan, R.11: Endocrinology 151 (2010) 1914-1922
Ziel war es, die Regulation von Endothelin 2 (EDN2) und die mögliche Bedeutung im Rinderovar zu erforschen. EDN2 mRNA wurde im Gelbkörper (CL) und während der follikulären-lutealen Übergangsphase induziert nach GnRH untersucht. EDN2 war nur im jungen CL erhöht und war nicht mehr nachweisbar im ausgereiften CL. Im jungen CL, EDN2 mRNA konnte hauptsächlich in Lutealzellen aber nicht in Endothelzellen nachgewiesen werden. In präovulatorischen Follikeln wurde EDN2 in Ganulosazellen exprimiert und nicht in der Theka interna. An kultivierten Granulosazellen wurde der Effekt von LH und Hypoxie auf die EDN2 Expression getestet. Es konnten mit beiden Faktoren deutliche stimulierende Wirkungen nachgewiesen werden. Dies wurde auch mit einer humanen GC Linie bestätigt. Hypoxie verstärkte auch VEGF und Cyclooxygenase 2. Humanes Choriongonadotropin hatte eine ähnliche Wirkung. Diese Ergebnisse lassen schlussfolgern, dass erhöhtes EDN2 im frühen CL, induziert durch den präovulatorischen LH Gipfel und Hypoxie, die CL Bildung beschleunigen durch Verstärkung von Angiogenese, Zellproliferation und Differenzierung.

Regulierung der Gelbkörper-Entwicklung und Funktionserhaltung unter besonderer Berücksichtigung der Angiogenese und der Wirkung von PGF2-alpha
Regulation of corpus luteum development and maintenance: specific roles of angiogenesis and action of prostaglandin F2?
Miyamoto, A.12; Shirasuna, K.12; Shimizu, T.12; Bollwein, H.13; Schams, D.:
Die Entwicklung des Gelbkörpers (CL) nach der Ovulation erfolgt sehr rasch in wenigen Tagen.
Hierbei werden die Theka- und Granulosazellen in Lutealzellen umgewandelt und mit neu gebildeten Blutkapillaren versorgt. Hierbei spielen lokal produzierte Faktoren (Fibroblasten Wachstumsfaktor, Vasoendothel Wachstumsfaktor, Insulin ähnliche Wachstumsfaktoren, vasoaktive Faktoren wie Stickstoffmonoxyd, Angiotensin 2 und Endothelin 1, Steroidhormone, Oxytocin und Prostaglandine) eine wichtige Rolle. Die Hauptfunktion des Gelbkörpers ist Progesteron zu produzieren, um eine etwaige Gravidität abzusichern. Ungenügende Luteinisierung und Angiogenese führt zu verminderter Progesteronproduktion, und damit zu reduzierter Embryonen-Entwicklung und Fertilität. PGF2-alpha, lokal besonders während der CL-Entwicklung produziert, verstärkt die Progesteronproduktion direkt oder indirekt durch Stimulierung der Bildung von VEGF und FGF2. Dies erklärt auch, warum exogene Prostaglandine während der CL-Anbildungsphase keine luteolytische Wirkung haben. Die Wechselwirkung zwischen luteotropen und luteolytischen Faktoren sowie Stimulation und Hemmung von angiogenen Faktoren während CL-Anbildung und Funktion haben essentielle Bedeutung für die CL-Funktion.

Die Expression von Leptin und seines Rezeptors während verschiedener physiologischer Stadien im Rinderovar
The expression of leptin and its receptor during different physiological stages in the bovine ovary
Sarkar, M.; Schilffarth, S.; Schams, D.; Meyer, H.H.D.; Berisha B.: Molecular Reproduction & Development 77 (2010) 174-181
Das hormonale Produkt des obese-Gens Leptin zirkuliert im Blutkreislauf und korreliert mit Fettreserven und Appetit. Beim Rind spielt Leptin auch eine Rolle für die Ovarfunktion. Die lokale Produktion sowie mögliche auto-parakrine Wirkungen sind unbekannt. Deshalb wurde im Gelbkörper (CL) die Expression von Leptin sowie Rezeptor (Ob-R) während des Zyklus, Luteolyse sowie im graviden CL untersucht. Zusätzlich wurde die Expression auch in Follikeln während der Endreifung in Theka (T) und Granulosa (GC) separat geprüft. Die mRNA wurde mittels RT-PCR (qPCR) getestet. Die höchste Expression wurde in kleinen Follikeln (3 – 5 mm, Östradiol       < 0,5 ng/ml FF) gefunden mit signifikanter Runterregulierung während der folgenden Endreifung und steigenden Östradiolkonzentrationen.
Im Gelbkörper stieg die Expression mit der Entwicklung an und fiel nach der Luteolyse ab. Während der Gravidität konnten keine regulatorischen Veränderungen bei hoher Expressionsintensität im CL gemessen werden. Die hohe lokale Expression im Ovar lässt lokale Wirkungen für die Follikelreifung sowie CL Funktion vermuten.

Die Expression von Thrombopoietin und seines Rezeptors während unterschiedlicher physiologischer Stadien im Rinderovar
The Expression of Thrombopoietin and its Receptor During Different Physiological Stages in the Bovine Ovary
Sarkar, M.; Schilffarth, S.; Schams, D.; Meyer, H.H.D.; Berisha, B.: Reproduction in Domestic Animals, in press
Die mögliche Bedeutung von Thrombopoietin (TPO) für die Ovarfunktion ist unbekannt. Deshalb wurde die Expression der mRNA von TPO und seines Rezeptors (c-MPL) im CL Gewebe sowie im Follikelgewebe geprüft. Die mRNA wurde mit RT-PCR sowie das Protein mit ELISA untersucht. In der frühen und späten Lutealphase sowie nach Luteolyse konnten im CL die höchste Expression gemessen werden. Während der Gravidität war im CL die Expression konstant und niedrig. Die TPO Gewebekonzentration zeigte einen ähnlichen Verlauf. Im Follikel war die TPO und c-MPL mRNA Expression in GC und T in kleinen Follikeln am höchsten und fiel mit weiterem Wachstum und ansteigenden Östradiolwerten signifikant ab. Die Ergebnisse lassen eine lokale Wirkung von TPO und seines Rezeptors im Ovar vermuten.

In vitro Systeme für die Erkennung früher embryo-maternaler Dialoge im Eileiter  des Rindes
In vitro systems for intercepting early embryo-maternal cross-talk in the bovine oviduct
Ulbrich, S.E.; Zitta, K.14; Hiendleder, S.15; Wolf, E.14: Theriogenology 73 (2010) 802-816
Ein umfassendes Verständnis der komplexen Embryo-maternalen Wechselwirkungen während des Präimplantationszeitraums erfordert die Analyse von sehr frühen Stadien der Schwangerschaft. Diese sind aufgrund der geringen Größe des Embryos und den lokalen parakrinen Interaktionen mit der Gebärmutterschleimhaut in vivo schwer durchzuführen. Holistische Transkriptom und Proteom-Analysen zur Untersuchung der frühen Embryo-maternalen Wechselwirkungen im Eileiter benötigen zudem eine ausreichende Menge an definierten Zellen aus standardisierten experimentellen Studien. Der vorliegende Übersichtsartikel beschreibt verbreitete Kulturmethoden und bewertet sie bezüglich
ihrer Eignung für Studien, die sich mit der physiologischen Interaktion von Embryonen und der maternalen Umgebung befassen. Die kurzfristige Kultur von bovinen Eileiterepithelzellen in Suspension bietet genau definierte und funktionelle Eileiterepithelzellen in ausreichender Menge für Experimente, bei denen die natürliche Umwelt der Eileiter in vivo nachgeahmt werden soll.

Auswirkungen einer verkürzten präovulatorischen Follikelphase auf die genitale Durchblutung und die Konzentration endometrialer Steroidhormonrezeptoren beim Rind
Effects of a shortened preovulatory follicular phase on genital blood flow and endometrial hormone receptor concentrations in Holstein-Friesian cows
Bollwein, H.13; Prost, D.13,16; Ulbrich, S.E.; Niemann, H.16; Honnens, A.13: Theriogenology 73 (2010) 242-249
Das Ziel dieser Studie war es, die Auswirkungen der Länge der präovulatorischen Follikelphase auf die genitale Durchblutung beim Rind zu untersuchen. Bei 50 Deutschen Holstein Kühen wurde mit einem modifizierten OvSynch Programm der Eisprung synchronisiert, indem die zweite GnRH-Injektion 40h (G40) oder 60h (G60) nach der PGF2alpha Injektion gegeben wurde. Die dritte Gruppe (S, n = 17) erhielt keine zweite GnRH-Injektion. Die Kühe der Gruppe G40 hatten 24 Stunden vor Ovulation geringere Follikeldurchmesser und einen niedrigeren follikulären Blutfluss als Kühe der Gruppe S. Sieben Tage nach dem Eisprung unterschieden sich der Durchmesser des Gelbkörpers und die Progesteronkonzentration zwar nicht zwischen Kühen der Gruppen G40 und S, aber der luteale Blutfluss war bei Kühen von Gruppe G40 niedriger als bei Kühen der Gruppen G60 und S. Weder die Durchblutung der Gebärmutter noch die Genexpression von Hormonrezeptoren der Gebärmutterschleimhaut waren unterschiedlich. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass eine verkürzte präovulatorische Follikelphase während einer Ovulationssynchronisation vor allem Auswirkungen auf den Eierstock und weniger auf die Gebärmutter haben.

Eine erhöhte proapoptotische Genexpression von XAF1, CASP8 und TNFSF10 im bovinen Endometrium während der frühen Gravidität ist nicht mit vermehrter Apoptose korreliert
Enhanced proapoptotic gene expression of XAF1, CASP8 and TNFSF10 in the bovine endometrium during early pregnancy is not correlated with augmented apoptosis
Groebner, A.E., Schulke, K.; Unterseer, S.; Reichenbach, H.D.17; Reichenbach, M.14; Büttner, M.18; Wolf, E.; Meyer, H.H.D.; Ulbrich, S.E.: Placenta 31 (2010) 168-177
Mit der rapiden Elongation des Trophoblasten vor der Implantation findet gleichzeitig eine massive Freisetzung von Interferon tau (IFN-?) durch Trophoblastzellen des Embryos statt. Aufgrund der proapoptotischen Eigenschaften von IFN-? haben wir den Effekt des Schwangerschaftserkennungssignals auf den programmierten Zelltod in der Gebärmutterschleimhaut analysiert. Die mRNA Expression der proapoptotischen Gene XIAP factor-1 (XAF1), Caspase 8 (CASP8) und TNF-Superfamilie Liganden 10 (TNFSF10) waren signifikant in der Gebärmutterschleimhaut von trächtigen Tieren erhöht. Eine IFN-? abhängige Induktion wurde innerhalb eines in vitro Ko-Kulturmodells endometrialer Zellen vor allem in Stromazellen bestätigt. Allerdings wurden weder eine erhöhte Caspase-Aktivität noch eine Erhöhung von apoptotischen Zellen im Uterus trächtiger Tiere gefunden. Obwohl IFN-? die Expression von proapoptotischen Gene induziert, findet also keine gleichzeitige Zunahme von apoptotischen Ereignissen statt. Diese Ergebnisse deuten auf eine spezifische Regulation der IFN stimulierten Gene auf die Freisetzung von IFN-? hin und lassen vermuten, dass zusätzliche Mechanismen den ungünstigen programmierten Zelltod von Endometriumszellen verhindern.

Unterschiedliche Entwicklung und Testosteronsekretion bei Zebu-Bullen (Bos indicus) und Kreuzungsbullen (Bos indicus x Bos taurus) sowie Büffeln (Bubalus bubalis) während des Wachstums
Divergent development of testosterone secretion in male zebu (Bos indicus) and crossbred cattle (Bos indicus x Bos taurus) and buffaloes (Bubalus bubalis) during growth
Gulia, S.19; Sarkar, M.; Kumar, V.19; Meyer, H.H.D.; Prakash, B.S.: Tropical Animal Health and Production 42 (2010) 1143-1148
Bos indicus x Bos taurus Bullen zeigen eine bemerkenswert späte Pubertät und niedrige Fertilität, welche bislang nicht verstanden ist. Unsere endokrinologischen Untersuchungen zeigen, dass bei den Kreuzungstieren der Testosterongehalt in allen Phasen signifikant niedriger ist als bei Bos indicus oder Bos taurus Bullen des gleichen Entwicklungsstadiums. Diese Befunde weisen darauf hin, dass die Kreuzungstiere nicht genetisch stabilisiert sind.
Bei Bullen des Murrah-Büffels zeigte sich zwar eine deutlich verzögerte Pubertätsentwicklung, auch endokrinologisch, aber adulte Tiere wiesen eine normale Fertilität bei entsprechenden Hormonwerten auf.

Seminalplasma vom Eber beeinflusst die Synthese von Prostaglandinen im Schweine Eileiter
Seminal plasma affects prostaglandin synthesis in the porcine oviduct
Kaczmarek, M.M.20; Krawcynski, K.20; Blitek, A.20, Kiewisz, J.20; Schams, D.; Ziecik, A.J.20: Theriogenology 74 (2010) 1207-1220
Bioaktive Substanzen im Seminalplasma können die zelluläre Zusammensetzung, Struktur und Funktion im Genitaltrakt verändern. Dies trifft besonders für den Eileiter zu. Deshalb wurde geprüft, ob eine intrauterine Infusion von Seminalplasma die Prostaglandinsynthese im Schweineeileiter beeinflussen kann. Deshalb wurden verschiedene Enzyme der Prostaglandinsynthese getestet. Am Tag 1 der Seminalplasma Infusion waren die wichtigsten Enzyme der PGF und PGE Synthese herunter reguliert. Am Tag 5 konnte eine gewisse Aufregulierung festgestellt werden. Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass Seminalplasma die Prostaglandinsynthese im Eileiter beeinflusst.

Wirkung von Luteinisierungshormon und Tumornekrosefactor alpha auf die VEGF Sekretion von kultivierten Schweine Endometrium Stromazellen
Effect of luteinizing hormone and tumour necrosis factor-alpha on VEGF secretion by cultured porcine endometrial stromal cells
Kaczmarek, M.M.20; Blitek, A.20; Schams, D.; Ziecik, A.J.20: Reproduction in Domestic Animals 45 (2010) 481-486
Die Bedeutung des Vasoendothel Wachstumsfaktors (VEGF) für die Vaskularisierung und Zellpermiabilität im Endometrium ist bereits gut dokumentiert. Wenig ist bekannt über die Stimulation der VEGF Sekretion im Endometrium während der Gravidität.
Deshalb wurde die Wirkung von Luteinisierungshormon (LH) und Tumornekrosefaktor alpha (TNF alpha) auf die VEGF Expression und Sekretion von Endometrium Stromazellen während der Frühgravidität beim Schwein untersucht. Mittels RT-PCR konnte eine höhere m-RNA Expression sowie Protein Sekretion (RIA) nachgewiesen werden. Es wird daraus geschlossen, dass beide Stimulatoren als potente Modulatoren für adaptive Veränderungen im uterinen Gefäßsystem während der Frühgravidität beim Schwein in Frage kommen.

III. Lebensmittel, Ernährung, Umwelt

Langzeitwirkungen von Mykophenolsäure auf die Expression von Immunglobulinen und Zytokinen in Schafen
Long-term effects of mycophenolic acid on the immunoglobulin and inflammatory marker-gene expression in sheep white blood cells
Dzidic, A.; Meyer H.H.D.; Bauer, J.6; Pfaffl, M.W.: Mycotox Res 26 (2010) 235-240
Mykophenolsäure (MPS) zeigt immunsuppresive Wirkungen und wird in der Humanmedizin bei Organtransplantationen eingesetzt. In der Landwirtschaft trifft man MPS oft als Nebenprodukt in schlechten Silagen an. Ziel der Studie war es, den Einfluss von MPS auf die Expression von Immunglobulinen (Ig?, Ig?, Igµ and Ig?2) und pro-inflammatorischen Zytokinen (TNF?, IL-1?, IL-1ß, IL-2 and IL-6) in Leukozyten (WBC) beim Schaf zu untersuchen. Es wurden 9 gesunde Schafe für 9 Wochen mit 300 mg MPS pro Tier und Tag behandelt und 9 unbehandelten Schafen gegenübergestellt. Mittels real-time qRT-PCR konnte die Expression von Immunglobulinen und inflammatorischen Markergenen exakt und zuverlässig quantifiziert werden. Es wurden keine Effekte von MPS auf die Höhe der Genexpression der Immunglobuline (Ig?, Ig?, Igµ and Ig?2) gefunden. Auch IL-2 and IL-6 zeigten ein konstantes Expressionsverhalten über die 9-wöchige Behandlung und wurden nicht durch MPS reguliert. TNF? zeigte eine signifikant erhöhte mRNA Expression nach einer Woche Behandlung, während IL-1? eine Abregulation nach 2 und 5 Wochen zeigte. Zusammenfassend ist zu sagen, dass hohe orale MPS Konzentrationen kaum immunmodulatorische Effekte auf die Expression von Immunglobulinen sowie Zytokinen in WBC aufweisen.

Einfluss von Probiotika und Inulin auf die Darmphysiologie von jungen Schweinen
Inulin and probiotics in newly weaned piglets: effects on intestinal morphology, mRNA expression levels of inflammatory marker genes and haematology
Mair, Ch.7,8; Plitzner, Ch.7; Pfaffl, M.W.; Schedle, K.7; Meyer, H.H.D.; Windisch, W.8: Archives of Animal Nutrition 64 (2010) 304-321
Ziel der vorliegenden Studie war es, den Effekt von Inulin (Prebiotikum) und eines Probiotikums auf die zootechnische Leistung, Mikroflora, intestinale Morphologie sowie immunologische und hämatologische Parameter zu untersuchen. In einem Versuch wurden 48 Absetzferkel in vier Gruppen eingeteilt: Kontrolle, Inulin (4 g/kg Frischmasse), Probiotika (1x109 KBE/kg Frischmasse, bestehend aus Enterokokken, Lactobacillen und Bifidobakterien) sowie Synbiotika (Kombination aus Inulin und Probiotika). Die zootechnischen Leistungen der Ferkel wurden in einem 28-tägigen ad libitum Fütterungsversuch mit konventionellem Trockenfutter erhoben. In gewonnenen Chymusproben wurden die Mengen ausgewählter Bakteriengruppen sowie der Gehalt an Milchsäure, kurzkettigen Fettsäuren und Ammoniak bestimmt. Des Weiteren wurden morphologische Untersuchungen der GIT Gewebeproben durchgeführt und die Zotten sowie Krypten vermessen. Zusätzlich wurde eine mRNA Expressionsanalyse von Markern des Zellzyklus sowie von Transkriptions- und Entzündungsfaktoren in ausgewählten Geweben und im Blut durchgeführt. Inulin und Probiotika hatten keinen signifikanten Einfluss auf die zootechnische Leistung über die gesamte Versuchsperiode. Im Bezug auf die Mikroflora zeigte Inulin höhere aerobe Gesamtkeimzahlen im Magen und Jejunum (p<0,05), sowie eine verringerte Anzahl an Enterokokken im Colon (p<0,05). Bedingt durch Inulin war die Essigsäurekonzentration erniedrigt (p<0,01) und gleichzeitig die Milchsäure im Colon erhöht (p<0,05). Die morphologischen Untersuchungen ergaben nur geringfügige Unterschiede bei der Anzahl an Becherzellen. Probiotika konnten die Milchsäurebakterien im distalen GIT sowie die gram-negativen Anaeroben im Colon erhöhen (p<0,01).
Weiters war der Trockenmassegehalt in Magen und Colon durch Probiotika erniedrigt (p<0,05), wohingegen die Essigsäure im Colon höhere Werte aufwies (p<0,05). Änderungen in der Histometrie durch den Einsatz von Probiotika zeigten sich vorwiegend im Dünndarm mit längeren Zotten im Jejunum (p<0,10) und einer höheren Anzahl an neutralen Becherzellen in den ilealen Zotten (p<0,05). Die mRNA Expressionen der inflammatorischen Markergene und Transkriptionsfaktoren, welche im Dünndarm keine Veränderungen in den Probiotikagruppen aufwiesen, zeigten im Colon und in den Leukozyten eine Aufregulation ausschließlich für die Probiotika behandelte Gruppe.
Insgesamt agierten beide Futteradditive bei einzelnen Parametern synergistisch. Nichtsdestotrotz wurden häufig ausgeprägte individuelle Effekte der experimentellen Faktoren beobachtet. Im Weiteren waren die Effekte nicht nur auf den Colon begrenzt, sondern wurden im Verlauf des gesamten GIT beobachtet.

Einfluss von Inulin und Laktulose auf die intestinale Morphologie bei Kälbern
Effects of inulin and lactulose on the intestinal morphology of calves
Masanetz, S.; Wimmer, N.; Plitzner, C.7; Limbeck, E.; Preißinger, W.9; Pfaffl, M.W.: Animal 4 (2010) 739-744
Es wurde bereits mehrfach gezeigt, dass Präbiotika wie etwa Inulin oder Laktulose einen positiven Einfluss auf die Gesundheit von Mensch und Tier haben können. Diese Einflüsse werden über die Stimulation probiotischer Bakterien und deren Metabolismus im Darm des Wirtes erzielt. Infolge dieser Erkenntnisse wurden Präbiotika bereits als mögliche Alternativen zu den mittlerweile nicht mehr zugelassenen antibiotischen Wachstumsförderern in der Haltung Lebensmittel liefernder Tiere gehandelt. Dem Einfluss von Inulin und Laktulose auf die intestinale Morphologie wurde in einer Fütterungsstudie mit 42 Kälbern nachgegangen.
Nach einer 20-wöchigen Fütterungsperiode zeigten Tiere der Inulin-Gruppe signifikant erhöhte tägliche Zunahmen im Vergleich zu der Laktulose-Gruppe. Die Kontrolltiere lagen zwischen diesen beiden Gruppen. Gleichzeitig zeigten die Laktulose gefütterten Tiere eine verminderte Aufnahme des Milchaustauschers. Umgekehrt verhielt sich die Zottenlänge sowohl im Jejunum (P=0.07) als auch im Ileum (P<0.05), wo Laktulose zu längeren, Inulin jedoch zu kürzeren Villi führte. Dazu passend war die Dichte an proliferierenden Zellen im Ileum in der Inulin-Gruppe tendenziell verringert und in der Laktulose-Gruppe erhöht (P=0.08). Beide Präbiotika tendierten zu einer Verminderung der Becherzellen in ilealen Zottenspitzen (P=0.07).
Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse einen klaren Effekt der Präbiotika Inulin und Laktulose auf die Tiergesundheit. Allerdings unterscheiden sich diese Effekte zwischen den beiden Substanzen. Während Inulin trotz einer verringerten Oberfläche im Dünndarm die Leistungsparameter verbesserte und nachgewiesen über verbesserte Blutwerte auch die Eisenabsorption positiv beeinflusst haben könnte, führte die Fütterung von Laktulose zu einer Verschlechterung der Tierleistung trotz verbesserter Darmarchitektur.

Einfluss von verzweigtkettigen Aminosäuren auf das Wachstumsverhalten, Blutmetaboliten, Enzymkinetik und deren Transkription in Ferkeln
The effects of branched-chain amino acid interactions on growth performance, blood matabolites, enzyme kinetics and transcriptomics in weaned pigs
Wiltafsky, M.K.10; Pfaffl, M.W.; Roth, F.X.10: British Journal of Nutrition 103 (2010) 964-976
Die Auswirkungen von übermäßigem Leucin in der Nahrung wurde in zwei Wachstumsversuchen mit Schweinen untersucht. In jedem Versuch wurden 48 Schweine (8 bis 25 kg) in sechs Versuchsgruppen eingeteilt. Behandlung 1 war eine positive Kontrolle. Die anderen Behandlungen hatte marginale Isoleucin- (Versuch 1) oder Valinkonzentrationen (Versuch 2). Die diätetischen Leucin Konzentrationen wurden schrittweise in den Behandlungen 2 bis 5 erhöht. In Behandlungsgruppe 6 wurden die Auswirkungen eines gleichzeitigen Überschusses von Leucin und Valin in Isoleucin limitierter Fütterung untersucht (Versuch 1), oder von Leucin und Isoleucin in Valin limitierter Fütterung (Versuch 2) untersucht. Eine Erhöhung der diätetischen Leucin verminderte die Wachstumsleistung und erhöhte den Leucingehalt im Plasma und die Serum ?-Ketoisocaproat Konzentartionen in einer linearen Dosis-Wirkungsbeziehung. Die erhöhten Isoleucin und Valin Plasmakonzentrationen und das Serum-?-Keto-?-Methylvalerinat und ?-Ketoisovalerat zeigten einen erhöhten Katabolismus. Eine lineare Erhöhung der basalen verzweigtkettigen Ketosäuren-Dehydrogenase Aktivität in der Leber bestätigt dies. Keine größeren Veränderungen traten im mRNA Expressionsmuster der Enzyme des verzweigtkettigen Aminosäuren Katabolismus auf. In der Leber jedoch sank der mRNA Spiegel von Wachstumshormon-Rezeptor (GHR) und Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) signifikant mit zunehmender diätetischen Leucin Konzentrationen. Zusammenfassend ist zu sagen, dass überschüssiges Leucin in der Nahrung den Abbau von verzweigtkettigen Aminosäuren hauptsächlich durch posttranskriptionelle Mechanismen erhöht. Die Auswirkungen des Leucin Überschusses auf die Wachstumshormonachse bedarf weiterer Untersuchungen.

Langzeitfütterung von gentechnisch verändertem Mais (MON810) – Verbleib der cry1Ab DNA und des rekombinanten Proteins im Stoffwechselprozess der Milchkuh
Long-term feeding of genetically modified corn (MON810) – Fate of cry1Ab DNA and recombinant protein during the metabolism of the dairy cow
Guertler, P.; Paul, V.; Steinke, K.; Wiedemann, St.; Preißinger, W.9; Albrecht, C.; Spiekers, H.9; Schwarz, F.J.10; Meyer, H.H.D.: Livestock Science 131 (2010) 250-259
Der Verbleib der cry1Ab DNA und des Cry1Ab Proteins wurde im Rahmen eines 25-monatigen Langzeitfütterungsversuchs mit Milchkühen der Rasse Fleckvieh untersucht. Diese wurden in zwei Gruppen aufgestellt (je 18 Tiere) und mit Rationen gefüttert, die entweder transgenen Mais (Event MON810) oder die nicht-transgene Vergleichssorte enthielten. Wöchentlich wurden Proben von allen Futterkomponenten, sowie monatlich auch Milch-, Blut- und Kotproben gezogen. Alle zwei Monate wurden auch Harnproben genommen. Für die Analytik wurden quantitative und qualitative PCR-Nachweissysteme und ein hoch-sensitiver ELISA entwickelt und an die verschiedenen Matrices angepasst. Diese Nachweismethoden wurden entsprechend der Richtlinien zum Nachweis von GVO validiert.
Die Untersuchungen ergaben, dass transgene Komponenten in Blut, Milch und Harn nicht detektierbar waren. Lediglich im Kot von transgen gefütterten Tieren konnte das Cry1Ab Protein nachgewiesen werden. Transgene DNA war auch hier nicht nachweisbar. Folglich konnte auch kein Übergang von transgenen Komponenten aus dem Futter in die Milch oder ins Blut der Kühe gezeigt werden.

Abbau des Cry1Ab Proteins aus gentechnisch verändertem Mais (MON810) im Verhältnis zum Gesamtprotein des Futters im Verdauungsprozess der Milchkuh
Degradation of Cry1Ab protein from genetically modified maize (MON810) in relation to total dietary feed proteins in dairy cow digestion
Paul, V.; Guertler, P.; Wiedemann, S.; Meyer, H.H.D.: Transgenic Research 19 (2010) 683-689
In dieser kurzen Studie wurde die Verdaulichkeit des Cry1Ab Proteins im Vergleich zum Gesamtprotein mittels ELISA und Western Blot untersucht. Diese fand im Rahmen des 25-monatigen Langzeitfütterungsversuchs mit gentechnisch verändertem Mais (MON810) bei Milchkühen statt. Acht Proben der partiellen totalen Mischration (PTMR; je 4 transgen und nicht-transgen) und 44 Kotproben (26 transgen, 18 nicht-transgen) wurden untersucht. Zusätzlich wurden im Anschluss an diesen Langzeitversuch Proben der Inhalte von Pansen, Abomasum, Blinddarm, Dünndarm und Dickdarm von je sechs Kühen untersucht. Die Analysen erfolgten mittels ELISA und BCA. Ausgehend vom Futter konnte eine Abnahme der relativen Cry1Ab Konzentration im Kot auf 44% festgestellt werden, was auf einen schnelleren Abbau des Cry1Ab Proteins hindeutet. Die relative Cry1Ab Konzentration in den Magen- und Darminhalten variierte zwischen 0,38 µg/g Gesamtprotein im Abomasum und 3,84 µg/g Gesamtprotein im Pansen. Western Blot Analysen zeigen einen Abbau des Cry1Ab Proteins in Fragmenten mit 42 kDa, 34 kDa und 17 kDa, wobei das 34 kDa große Fragment das dominanteste Abbauprodukt darstellt.
Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Cry1Ab Protein weniger stabil ist im Vergleich zu anderen Proteinen im Futter.

Langzeiteffekte einer Fütterung mit gentechnisch verändertem Mais (MON810) auf die Leistung laktierender Milchkühe
Effects of long-term feeding of genetically modified corn (event MON810) on the performance of lactating dairy cows
Steinke, K., Guertler, P., Paul, V., Wiedemann, S., Ettle, T.9, Albrecht, C., Meyer, H.H.D., Spiekers, H.9, Schwarz, F.J.10; Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition 94 (5) (2010) 185-193
Um mögliche Effekte einer Fütterung mit gentechnisch verändertem Mais (MON810) auf die Gesundheit und Leistung von Milchkühen zu untersuchen, wurde ein Langzeitversuch über 25 Monate durchgeführt, bei dem je 18 Tiere entweder mit gentechnisch verändertem Mais oder mit der nicht-transgenen Vergleichssorte gefüttert wurden. Beim Futter konnten weder in der chemischen Zusammensetzung, noch im Energiegehalt Unterschiede zwischen dem transgenen und dem nicht-transgenen Mais festgestellt werden. Eine durchschnittliche tägliche Aufnahme von 6 mg Cry1Ab Protein fand während der ersten Laktation statt. In der zweiten Laktation stieg die mittlere tägliche Aufnahme auf 6,1 mg Cry1Ab pro Tag. Die Fütterung mit gentechnisch verändertem Mais hatte keinen Einfluss auf die Futteraufnahme und die Milchleistung in beiden Laktationszeiträumen. In Bezug auf die Zusammensetzung der Milch und die Tiergesundheit konnte ebenfalls kein Unterschied festgestellt werden zwischen den beiden Versuchsgruppen.


IV. Wachstumsphysiologie, myotrope Therapeutika und Anabolika

Einfluss von Trenbolonacetat plus Estradiol auf verschiedene Stoffwechselwege in der bovinen Leber
Effect of trenbolone acetate plus estradiol on transcriptional regulation of metabolism pathways in bovine liver
Becker, C.; Riedmaier, I.; Reiter, M.21; Tichopad, A.; Pfaffl, M.W.; Meyer, H.H.D.: Hormone Molecular Biology and Clinical Investigation 2 (2010) 257-265
Es ist zu erwarten, dass verschiedene Stoffwechselwege von der exogenen Zufuhr von anabolen Steroiden beeinflusst werden, was die Leber zu einem vielversprechenden Organ in der Biomarkersuche macht. Ein Versuch mit 18 Ngunifärsen wurde durchgeführt, in dem 9 Tiere mit einer anabolen Kombination aus Trenbolonacetat und Estradiol behandelt wurden. Die restlichen 9 Tiere dienten als Kontrollgruppe. In der Analyse der Genexpression mittels RT-qPCR konnten signifikante Unterschiede in verschiedenen Gengruppen (Rezeptoren, Protein- und Cholesterolstoffwechsel, endokrine Faktoren und Hormonausscheidung) detektiert werden. Die biostatistische Auswertung der Daten mittels Hauptkomponentenanalyse (PCA) zeigte, dass es möglich sein könnte, in der Leber ein Muster von Genexpressionsbiomarkern zur Erkennung des Missbrauchs anaboler Steroide zu etablieren.

Einfluss von Trenbolonacetat plus Estradiol auf verschiedene Stoffwechselwege in der bovinen Leber
Effect of trenbolone acetate plus estradiol on transcriptional regulation of metabolism pathways in bovine liver
Becker, C.; Riedmaier, I.; Reiter, M.21; Tichopad, A.; Pfaffl, M.W.; Meyer, H.H.D.: Hormone Molecular Biology and Clinical Investigation 2 (2010) 257-265
Es ist zu erwarten, dass verschiedene Stoffwechselwege von der exogenen Zufuhr von anabolen Steroiden beeinflusst werden, was die Leber zu einem vielversprechenden Organ in der Biomarkersuche macht. Ein Versuch mit 18 Ngunifärsen wurde durchgeführt, in dem 9 Tiere mit einer anabolen Kombination aus Trenbolonacetat und Estradiol behandelt wurden. Die restlichen 9 Tiere dienten als Kontrollgruppe. In der Analyse der Genexpression mittels RT-qPCR konnten signifikante Unterschiede in verschiedenen Gengruppen (Rezeptoren,
Protein- und Cholesterolstoffwechsel, endokrine Faktoren und Hormonausscheidung) detektiert werden. Die biostatistische Auswertung der Daten mittels Hauptkomponentenanalyse (PCA) zeigte, dass es möglich sein könnte, in der Leber ein Muster von Genexpressionsbiomarkern zur Erkennung des Missbrauchs anaboler Steroide zu etablieren.

V. Wildtierbiologie

Wechselwirkung zwischen Rangordnung und Plasma Testosteron und Cortisol beim Rothirsch
Relationship between rank and plasma testosterone and cortisol in red deer males (Cervus elaphus)
Bartos, L.23, Schams, D., Bubenik, G.A.24, Kotrba, R.23, Tomanek, M.25: Physiology & Behavior 101 (2010) 628-634
Es sollte geprüft werden, inwieweit eine Veränderung der Sozialstruktur in einer Gruppe von Rothirschen sich auf die Wechselbeziehung Rankordnung und Testosteronspiegel auswirken. Eine Gruppe von 12 erwachsenen Hirschen wurde separat gehalten (Periode 1). Danach wurden 9 Junghirsche hinzugegeben (Periode 2). Während einer definierten Beobachtungszeit wurden die Interaktionen beobachtet und Blutproben entnommen während der 2 Beobachtungsperioden. Die Zugabe von jungen Hirschen änderte das agonistische Verhalten der erwachsenen Hirsche. Alte Hirsche attackierten bevorzugt Hirsche mit niedriger Hierarchie. Hirsche mit hoher Rankordnung hatten niedrigere Testosteronwerte innerhalb der Erwachsenengruppe (Periode 1). Nach Hinzugabe der Junghirsche war es gerade das Gegenteil (Periode 2). In Periode 1 hatten die Tiere höhere Cortisolwerte als in Periode 2. Als Kontrolle wurden Erwachsene und Junghirsche zusammen gehalten. Keine hormonellen Veränderungen wurden gemessen. Die Ergebnisse belegen klar den Einfluss der sozialen Umgebung von erwachsenen Hirschen. Veränderungen bewirken Wechsel im Rang sowie Testosteron und Cortisol-Blutspiegel.


VI. Bioanalytik

Bedeutung der Qualitätskontrolle von mRNA und microRNA für die Analytik mittels RT-qPCR
mRNA and microRNA quality control for RT-qPCR analysis
Becker, C.; Hammerle-Fickinger, A.; Riedmaier, I.; Pfaffl, M.W.: Methods 50 (2010) 237-243
Hammerle-Fickinger, A.; Riedmaier, I.; Becker,C.; Meyer, H.H.D.;  Pfaffl, M.W.; Ulbrich, S.E.: Validation of extraction methods for total RNA and miRNA from bovine blood prior to quantitative gene expression analyses.
Biotechnology Letters 32 (2010) 35-44
Die Methodik der quantitativen RT-PCR ist derzeit der Goldstandard für die Messung von Genexpressionsunterschieden. Messenger RNAs (mRNAs) sind jedoch sehr labile Moleküle, die auf Grund des ubiquitären Vorkommens von Nukleasen einem ständigen Risiko der Degradierung unterworfen sind. Der immense Einfluss der Probenqualität auf die quantitative Aussage der Messung wurde für mRNAs klar dargelegt. Die Qualitätskontrolle von mRNAs mittels automatisierter Elektrophorese wird von den MIQE Richtlinien als essentieller Routineschritt in der Probenvorbereitung angesehen.
Die vorliegende Studie zeigt den Einfluss der Extraktionsmethode auf die Qualität und Quantität der mRNA als auch der microRNA. In der zweiten Studie konnte klar bewiesen werden, dass auch in der Untersuchung von microRNAs mittels real-time RT-PCR ein Zusammenhang zwischen dem Degradierungsgrad und dem Ergebnis der RT-PCR besteht. Somit sollte eine Qualitätskontrolle auch bei neuen Anwendungen wie der Expressionsanalytik von mRNAs oder microRNAs durchgeführt werden.

Vergleich der Analyse des Metaboloms in Blutplasma- und Blutserumproben mittels Gas-Chromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie (GC-MS)
Comparison of serum versus plasma collection in gas chromatography – Mass spectrometry-based metabolomics
Dettmer, K.26; Almstetter, M.F.26; Appel, I.J.26; Nürnberger, N.26; Schlamberger, G.; Gronwald, W.26; Meyer, H.H.D.; Oefner, P.J.: Electrophoresis 31 (2010) 2365-2373
In der vorliegenden Studie wurden Blutserum-, EDTA-Blutplasma-, und mit Acetylsalicylsäure
versetzte EDTA-Blutplasmaproben (EDTA-ASA) hinsichtlich Ihrer Eignung für Studien des Metaboloms getestet. „Fingerabdrücke“ des Metaboloms wurden mit Gas-Chromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie erstellt und die Daten mit der Leco Chroma-TOF® Software ausgewertet. Insgesamt wurden 6, 9 und 21 Merkmale mit einer Fehlerrate von < 5 % mittels INCA beim Vergleich von EDTA-Blutplasma- mit EDTA-ASA-Blutplasma- und Blutserumproben, sowie Blutserum- mit EDTA-ASA-Blutplasmaproben gefunden. Um sicher zu stellen, dass beobachtete Signalintensitäten am Massenspektrometer auch wirklich von den Metaboliten und deren Konzentration selbst her stammen, wurden 19 Aminosäuren, Glukose und 6 organische Säuren, die mit stabilen Isotopen gekennzeichnet waren, als interne Standards verwendet und gemessen. An der gemessenen Konzentration der Standards wurde die Quantifizierung der Metaboliten vorgenommen. Lediglich die Konzentration von Laktat und Citrat waren in den EDTA-Blutplasma- und den Blutserumproben geringer, während die Konzentration aller anderen Metaboliten  in den drei Probentypen vergleichbar waren.

Statistische Aspekte des Designs von quantitativen real-time PCR Experimenten
Statistical aspects of quantitative real-time PCR experiment design
Kitchen, R.R.27; Kubista, M.28,29; Tichopad, A.: Methods 50 (2010) 231-236
Versuche mit quantitativer real-time PCR werden von einer biologischen wie auch einer technischen Streuung beeinflusst. Durch eine Optimierung des Experimentdesigns wird versucht, die Quellen der technischen Streuung zu minimieren. Die Qualität eines Versuches wird häufig mit Hilfe der Powerberechnung geschätzt. In diesem Artikel wird eine Methode vorgestellt, welche an Hand eines Pilotversuches ein optimales Experimentdesign mit optimalem Einsatzort und optimaler Anzahl an Probenreplikaten entworfen wurde, und mit welcher ebenfalls eine Powerschätzung vorgenommen werden kann. Zusätzlich wird ein Effekt der Normalisierung mit einem Referenzgen und ihre mögliche negative Auswirkungen diskutiert. Zuletzt wird schließlich eine Software vorgestellt, mit welcher man alle hier erwähnten Berechnungen durchführen kann.

Normalisierungsstrategien für microRNA Profiling Experimente: Ein ‘normaler’ Weg zu einer verborgenen komplexen Ebene?
Normalization strategies for microRNA profiling experiments: a „normal” way to a hidden layer of complexity?
Meyer, S.U.; Pfaffl, M.W., Ulbrich, S.E.: Biotechnol Lett 32 (2010) 1777-1788
MicroRNA (miRNA)-Profiling ist ein erster wichtiger Schritt bei der Bestimmung der miRNA Funktionen. Real time quantitative PCR (RT-qPCR) und Hybridisierungsmicroarray-Verfahren sowie Ultra-Hochdurchsatz-Sequenzierung von miRNAs (kleine RNA-seq) sind beliebte und verbreitete Profiling-Methoden. Alle diese drei Profiling-Methoden sind gekennzeichnet durch eine signifikante Einführung von Bias. Normalisierung, ein häufig unterschätzter Aspekt der Datenprozessierung, kann systematische, technische oder experimentelle Variation minimieren und besitzt dadurch signifikanten Einfluss auf die Detektion differentiell exprimierter miRNAs. Zurzeit existiert keine allgemein gebräuchliche Normalisierungsmethode für einen der drei miRNA-Profiling Methoden. Zahlreiche Normalisierungsmethoden werden derzeit verwendet, von denen einige ähnlich zu mRNA-Profiling-Methoden sind, während andere wiederum  für miRNA-Datensätze spezifisch modifiziert bzw. entwickelt wurden. Die charakteristischen Eigenschaften der miRNA-Moleküle, ihre Zusammensetzung und die daraus resultierende Datenverteilung der Profiling-Experimente fordern die Wahl einer angemessenen Normalisierungsmethode heraus. Basierend auf miRNA-Profiling Studien und vergleichenden Studien über Normalisierungsmethoden und deren Eigenschaften stellt dieser Review einen kritischen Überblick über häufig verwendete sowie neu entwickelte Normalisierungmethoden für miRNA RT-qPCR, miRNA-Hybridisierungsarrays und kleine RNA-seq Datensätze bereit. Die Schwerpunkte beziehen sich auf die Komplexität, deren Bedeutung und das Potential für weitere Optimierung der Normalisierungsmethoden für miRNA-Profiling-Datensätze.

Quantitative PCR
The ongoing evolution of qPCR (Guest Editor´s Introduction)
Pfaffl, M.W.: Methods 50 (2010) 215-216
Die RT-PCR zum spezifischen Nachweis der mRNA ist seit der Erfindung in den 80er Jahren durch Kary Mullis zu einem Routinewerkzeug in jedem molekularbiologischen Labor geworden. Die Weiterentwicklung der klassischen RT-PCR ist die quantitative oder real-time RT-PCR (qRT-PCR), die erstmals 1991 vorgestellt wurde und neben qualitativen Aussagen auch eine exakte Quantifizierung ermöglicht.
Die qPCR hat erhebliche Vorteile bei der Quantifizierung geringer Kopienzahlen in Biopsien oder in einzelnen Zellen. Um das gesamte quantitative Potential der qPCR auszuschöpfen ist ein umfassendes Verständnis der zugrundeliegenden Methode, Amplifizierungskinetik sowie der Fehlerquellen nötig. Leider sind wir weit davon entfernt, die optimalen PCR Arbeitsabläufe, die höchste Sensitivität, die geringsten Varianzen, die beste RNA Integrität oder das ultimative Echtzeit PCR Gerät zu bauen, die alle unentbehrlich für eine optimale PCR-Amplifikation und authentische Ergebnisse sind. Die bis dato entwickelte Methodik muss mit zunehmenden analytischen Herausforderungen weiterentwickelt werden, was uns zum folgenden Thema des PCR Sonderheftes führt - The ongoing evolution of qPCR.
In diesem Kompendium haben wir auf einige ausgewählte Anwendungsbereiche zusammengefasst, die uns besonders wichtig für die zukünftige Forschung und Diagnostik erscheinen: MIQE Richtlinien und Standardisierung der Methode, Analytik von microRNAs, hochauflösende Schmelzkurvenanalyse (HRM), Copynumber Variationen (CNV), quantitative single-cell Expressionsanalytik, zirkulierende Tumorzellen (CTC), zirkulierende Nukleinsäuren (CNA) und nicht zuletzt die qPCR Datenanalyse.
Fazit - Die letzten zwei Jahrzehnte in der Anwendung der PCR und real-time PCR wurden durch wichtige methodische Fortschritte geprägt. Die entwickelten MIQE Richtlinien sollen uns helfen, die qPCR besser zu standardisieren und in Folge die Ergebnisse besser und aussagekräftiger zu machen. Aber wir müssen uns bewusst sein, dass die Evolution der qPCR weiter fortschreitet und immer ein wichtiges Glied in der molekularbiologischen Forschung bleiben wird.

Qualitätskontrolle für quantitative PCR basierend auf dem Amplifikations-Kompatibilitätstest
Quality control for quantitative PCR based on amplification compatibility test
Tichopad, A.; Bar, T.30; Pecen, L.29; Kitchen, R.R.27; Kubista, M.28,29; Pfaffl, M.W.: Methods 50 (2010) 308-312
Quantitative real-time PCR wird zur Routine überall dort eingesetzt, wo eine genaue Quantifizierung von Nukleinsäuren nötig ist. Fehler in der Quantifizierung sind jedoch kaum zu vermeiden, sobald eine Inhibition oder andere Störfaktoren, wie z.B. die Bildung von Primerdimeren, in der Reaktion vorkommen. Obwohl verschiedene, gut etablierte Methoden diese Fehler schon während der Probenaufbereitungsphase kontrollieren können, beinhalten all diese Methoden eine Manipulation der Probe, die möglicherweise zu einer Beeinflussung des Ergebnisses führen kann. In diesem Artikel soll eine auf der multivariaten Datenanalyse basierende statistische Methode präsentiert werden, welche die Amplifikationsdaten der PCR Reaktion untersuchen kann und anschließend einen qualitätsbezogenen Rückschluss zu jeder Probe erlaubt. Diese Methode untersucht zwei oder mehrere ausgewählte Merkmale der Amplifikationstrajektorie und berechnet anschließend eine Z-Score Statistik für jede Probe. Ausreißer werden dann mit Hilfe der schließenden Statistik gegenüber einer Referenzgruppe oder gegenüber der Gesamtheit aller Proben aussortiert. An Hand von einem Versuch mit künstlicher Inhibition konnte gezeigt werden, dass im Vergleich zu einer auf univariaten Statistik basierten Methode diese Methode deutlich bessere Ergebnisse aufweist.

Darstellung des Genexpressionsprofils geschlechtlicher Unterschiede in HIF1- abhängigen adaptiven kardialen Antworten auf chronische Hypoxie
Gene expression profiling of sex differences in HIF1-dependent adaptive cardiac responses to chronic hypoxia
Bohuslavova, R.29; Kolár, F.31; Kuthanova, L.29; Neckar, J.31; Tichopad, A.; Pavlinkova, G.29: Journal of Applied Physiology 109 (2010): 1195-1202
Obwohl die physiologische Antwort auf eine chronische Hypoxie heutzutage gut beschrieben ist, bleiben die Anpassungsmechanismen der Lunge und des Herzens weitgehend unbekannt. Hierfür wurde die Hypothese, dass eine adaptive Antwort auf eine chronische Hypoxie ein Ergebnis der veränderten Genexpression der rechten und linken Ventrikel ist, erhoben und getestet. Dieser Artikel beschreibt die Befunde der Genexpressionsprofilierung bei Herzen von sich adaptiv auf Hypoxie anpassenden Mäusen. Von den 11 untersuchten Kandidatengenen waren sieben Gene bei Männchen und vier bei Weibchen in den rechten Ventrikeln reguliert. In dem Expressionsprofil der linken Ventrikel wurde nur eine Änderung des Vegfa-Genes bei hypoxischen Männchen gefunden. Hiermit wurde gezeigt, dass eine Hypoxie eine selektive Genexpressionswirkung vorwiegend auf die rechten Ventrikel aufweist und dass beide Ventrikel voneinander unabhängig reagieren können. Eine gezielte Untersuchung des HIF1-Genes bei HIF1-inaktiven Tieren ergab, dass HIF1 eine wichtige Rolle bei der Anpassungsfähigkeit von Lunge und Herz spielt. Zuletzt wurde gezeigt, dass beide Geschlechter in Ihrer Antwort auf eine Hypoxie unterschiedliche Expressionsmechanismen aktivieren.

Effekte des Bacillus firmus auf die Expression von Zytokinen und Toll-like Rezeptoren in murinem Nasopharynx assoziierten lymphatischen Gewebe nach intranasaler Immunisierung mit inaktivierten Influenza Typ A Viren
Adjuvant effect of Bacillus firmus on the expression of cytokines and toll-like receptors in mouse nasopharynx-associated lymphoid tissue (NALT) after intranasal immunization with inactivated influenza virus type A
Zanvit, P.32; Tichopad, A.; Havlicková, M.33; Novotna, O.32; Jirkovská, M.34; Kolostova, K.35; Cechová, D.32; Julak, J.32; Sterzl, I.32; Prokesova, L.32: Immunology Letters 134 (2010) 26-34
Auf Grund der bestehenden Gefahr einer Neuentwicklung einer hochpathogenen Typ-A Influenza ist eine potente und kreuz-protektive mukosale Vakzinierung erwünscht. Mit Hilfe von delipidierten Bacillus firmus (DBF) als Adjuvans wurde eine mukosale Immunisierung mit einem inaktiven Influenza-A-Virus bei Mäusen durchgeführt. Der Mechanismus eines adjuvanten Effektes wurde anschließend im NALT (Nasal Lymphoid Tissue) untersucht. Ein Vergleich wurde durchgeführt zwischen der Immunisierung mit: i) dem inaktivierten Influenzavirus A (H1N1) alleine, ii) dem DBF alleine und iii) der Mischung von DBF und Virus. Die Genexpression ausgewählter Zytokine (IL-2, IFN-?, IL-4, IL-6, und IL-10), Type-I Interferone (IFN-?4, IFN-?11, IFN-?12, IFN-?), Toll-like Rezeptoren (TLR2, TLR3, TLR7, TLR9), sowie iNOS und CCR7 wurde mittels qPCR an 7 verschiedenen Zeitpunkten gemessen. Die intranasale Verabreichung von DBF und der Mischung von Virus und DBF verursachte eine erhöhte Expression von IFN-?, IL-6 und IL-10, Type-I Interferonen, iNOS, und pDC-Marker im NALT. Das DBF zeigte sich als effektiver Stimulus der angeborenen Immunität nach einer intranasalen Immunisierung. DBF beschleunigte nicht nur, sondern erhöhte und verlängerte die antivirale Antwort.

Verzögerung des intra-erythrozytischen Zyklus und Erhöhung der Expression von Arzneimittel-Transporter Genen bei Plasmodium falciparum durch Behandlung mit Medikamenten gegen Malaria
Antimalarial exposure delays Plasmodium falciparum intra-erythrocytic cycle and drives drug transporter genes expression
Veiga, M.I.36,37; Ferreira, P.E.36,37; Schmidt, B.A.36; Ribacke, U.37; Björkman, A.36; Tichopad, A.; Gil, J.P.36,37,38: PLoS One 5 (2010) 1-8
Eine multiple Drug-Resistenz bei Plasmodium falciparum ist das Haupthindernis auf dem Weg zu einer erfolgreichen Kontrolle der Malaria. Zelluläre Resistenzmechanismen, die mit der metabolischen Aktivität zusammenhängen, wurden auch in eukaryotischen Zellen, wie z.B. Krebszellen, nachgewiesen. Neuste Beobachtungen weisen darauf hin, dass ein solcher Mechanismus in Plasmodium falciparum auftritt. Deswegen wurde der Effekt von Mefloquine auf den Zellzyklus von drei P. falciparum Klonen (3D7, FCB, W2) mit unterschiedlichen Arzneimittelanfälligkeiten untersucht. Gleichzeitig wurde die Expression von vier Genen, die für bestätigte und mutmaßliche Arzneimitteltransporter (pfcrt, pfmdr1, pfmrp1 and pfmrp2) kodieren, gemessen. Mefloquine induzierte eine Dosis- und Klon-abhängige Verzögerung im intra-erythrocytären Zyklus des Parasiten. Der Einfluss der Substanz auf den Fortschritt des Zellzyklus wurde dann unter Nutzung eines nicht-linearen Regressionsmodels mit der Genexpression zusammengeführt, um die spezifische substanzinduzierte Expression zu bestimmen. Dies ergab eine milde, aber signifikante Induktion der Genexpression um bis zu 1,5 fach durch Mefloquine.

 

  1. Institute of Functional Genomics, University of Regensburg
  2. Institut für Biophysik und physiologische Biochemie der Universität Regensburg
  3. Clinic for Cattle, University of Veterinary Medicine, Hannover
  4. Gissel-Institut, Laboratory for Bacteriology and Food Hygiene, Hannover
  5. Lehrstuhl für Tierzucht, Technische Universität München
  6. Research Group of Functionas Genomics, Leibnitz Institute of Fram Animal Biology, Dummersorf, Germany
  7.  Institute of Animal Nutrition, Products and Nutrition Physiology, VIBT – Vienna Institute of BioTechnology
  8. BOKU – University of Natural Resources and Applied Life Sciences, Vienna, Austria
  9. Institut für Tierernährung und Futterwirtschaft, Bayerische Landesanstalt für Landwirtschaft (LfL), Poing-Grub
  10. Lehrstuhl für Tierernährung, Technische Universität München, Freising-Weihenstephan
  11. Department of Animal Sciences, The Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food, and Environment, The Hebrew University of Jerusalem, Israel
  12. Graduate School of Animal and Food Hygiene, Obihiro University of Agriculture and    Veterinary Medicine, Obihiro, Japan
  13. Clinic for cattle, University of Veterinary Medicine Hannover
  14. Chair for Molecular Animal Breeding and Biotechnology, and Laboratory for Functional Genome Analysis (LAFUGA), Gene Center, LMU Munich
  15. JS Davies Epigenetics and Genetics Group, School of Agriculture, Food & Wine and Research     Centre    for Reproductive Health, The University of Adelaide, Roseworthy Campus, Adelaide, Australia
  16. Institute of Farm Animal Genetics, Friedrich-Loeffler-Institute (FLI), Mariensee, Neustadt
  17. Institute of Animal Breeding, Bavarian State Institute for Agriculture, Grub
  18. Bavarian Health and Food Safety Authority, Oberschleißheim
  19. Dairy Cattle Physiology Division, National Dairy Research Institute, Karnal, India
  20. Institute of Animal Reproduction and Food Research, Polish Academy of Sciences, Olsztyn, Poland
  21. Bavarian State Research Center for Agriculture, Institute of Animal Breeding, Grub, Germay
  22. Charité Universitätsmedizin Berlin, Campus Virchow-Klinikum, Department of Nephrology and Medical Intensive Care, Berlin, Germany
  23. Department of  Ethology, Institute of Animal Science, Praha, Czech Republic
  24. Department of Integrative Biology, University of Guelph, Guelph, Ontario, Canada
  25. Biology of Reproduction, Institute of Animal Science, Praha, Czech Republic
  26. Institute of Functional Genomics, University of Regensburg
  27. School of Physics, University of Edinburgh, Edinburgh EH8 9AB,UK
  28. TATAA Biocenter, Göteborg, Sweden
  29. Institute of Biotechnology AS CR, Videnska, Prague, Czech Republic
  30. Labonnet Ltd. Itamar St. 10/1, Ramat-Gan, Israel
  31. Institute of Physiology AS CR, v.v.i., and Centre for Cardiovascular Research, Prague, Czech Republic
  32. Charles University in Prague, First Faculty of Medicine, Institute of Immunology and Microbiology,          Prague, Czech Republic
  33. National Institute of Public Health, Srobárova, Prague, Czech Republic
  34. Charles University in Prague, First Faculty of Medicine, Institute of Histology and Embryology, Prague,   Czech Republic
  35. Charles University in Prague, Third Faculty of Medicine, Department of Tumor Biology, Prague, Czech    Republic
  36. Malaria Research Lab, Department of Medicine, Karolinska Institute, Stockholm, Sweden
  37. Drug Resistance and Pharmacogenetics Group, Institute of Biotechnology and Bioengineering,  Centre of Molecular and Structural Biomedicine, University of Algarve, Faro,Portugal
  38. Laboratory of Molecular Anthropology and Health, Department of Anthropology, Binghamton, University, Binghamton, New York, United States of America


© Lehrstuhl für Tierphysiologie und Immunologie    

    Letzte Änderung: 29.10.2015