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Studien zur rekombinanten DNA und dem Cry1Ab-Protein

Abschlussbericht zum Forschungsvorhaben
"Einsatz von transgenem Mais (MON810) bei Milchkuehen:
Abbau, Transfer sowie potentielle Interaktionen von DNA und BT-Protein im Rind"

Vorstellung der Ergebnisse
Abschlussbericht zum Forschungsvorhaben
Diskussion

Anlage 1
Anlage 2
Anlage 3

Anlage 4

Anlage 5

Anlage 6

Anlage 7

Abbau von gentechnisch verändertem Mais bei Wildschwein und Damhirsch

Pressemitteilung
Guertler, P., et al., European Journal of Wildlife Research 54 (2008) 36-43
Wiedemann, S., et al., Mammalian Biology 74 (2009) 191-197

1. Gentechnisch veraenderte Lebens- und Futtermittel
2. Studien am Lehrstuhl fuer Physiologie
3. Stellungnahmen
4. Glossar
5. Kooperationen und Links
6. Literatur zum Thema

1. Gentechnisch veraenderte Lebens- und Futtermittel 

1.1. Anbau gentechnisch veraenderter Pflanzen

Die langwirtschaftliche Nutzung gentechnisch veraenderter Pflanzen nimmt seit 1996 stetig zu. 1996 betrug die globale Anbauflaeche 1,7 Millionen Hektar. Bis 2007 stieg die Gesamtflaeche weltweit auf 114,3 Millionen Hektar an (Abb. 1). Dabei ist die Sojabohne mit 58,6 Millionen Hektar weltweit die am haeufigsten angebaute gentechnisch veraenderte Pflanze, vor Mais, der Baumwolle und dem Raps.

Abbildung 1: Globaler Anbau gentechnisch veraenderter Pflanzen von 1996 bis 2006 (James, C. 2006. Global Status of Commercialized Biotech /GM Crops: 2006. ISAAA Brief No. 35., ISAAA: Ithaca NY)  

1.2 Maiszuensler (Ostrinia nubililalis)

Der Maiszuensler ist einer der gefuerchtetsten Schaedlinge im Maisanbau. Er vernichtet jaehrlich weltweit über 7% der Maisernte. Durch den Bohrfrass der Zuenslerraupe im Stengel und Kolben kann es zum Umknicken der durchbohrten Stengel und zum Abbrechen der Kolben kommen, wodurch der Ertrag der Maispflanzen gemindert wird. Zusaetzlich wird der Mais dadurch geschaedigt, dass die Frassloecher als Eintrittstellen, z.B. fuer Fusarien dienen. Die Raupen des Maiszuenslers ueberwintern in Ernterueckstaenden und Maisstoppeln und verpuppen sich im Mai. Die Falter schluepfen noerdlich der Alpen im Juni/Juli aus. Die geschlechsreifen Falter legen ihre Eier auf der Unterseite der Maisblaetter in dachziegelartiger Anordnung zu 10 bis 30 Stueck ab. Die jungen Raupen schluepfen nach ca. einer Woche. Anfangs fressen die Raupen oberflaechlich an den Blaettern und Rispen und bohren sich nach ein bis zwei Haeutungen in den Stengel.

Die direkte Bekaempfung mit oberflaechlich verspruehten Insektiziden ist nur waehrend der kurzen Zeit wirksam, in der sich die Larven noch auf der Oberflaeche befinden. Larven, die sich bereits in das Pflanzengewebe gebohrt haben, lassen sich mit chemischen oder biologischen Spritzmitteln nicht mehr bekaempfen.  

1.3. Bacillus thurinigiensis (Bt)

Bacillus thuringiensis ist ein ubiquitaer vorkommendes und sporenbildendes Bakterium, das weniger im Boden, als viel mehr auf pflanzlichem Material wie Blaettern oder auch Getreidekleie aus Muehlen zu finden ist (Smith and Couche, 1991; Meadows et al., 1991). Auf der Pflanzenoberflaeche wird das Bakterium mit einer hohen Wahrscheinlichkeit von einem herbivoren Insekt aufgenommen. Wie bei allen sporenbildenden Bakterien findet ein Wechsel zwischen vegetativer Wachstumsphase mit intensivem Stoffwechsel und einer anschliessenden Ruhephase als inaktive Spore statt. Bei Erschoepfung eines Naehrstoffes kommt die Zellteilung zum Stillstand und die Sporulation wird eingeleitet. Es bildet sich ein Sporangium. Dieses enthaelt die eigentliche Spore, sowie parasporale Proteinkristalle, welche vom Endo- bzw. Exosporium umgeben sind. (Abb. 2)

Abbildung 2: Bacillus thuringiensis (de Maagd et al., 2001)

Sp: spore, PB: proteinbody

Bacillus thuringiensis synthetisiert neben Phospholipase und immunsuppressiven Substanzen ein insektizid wirkendes d-Endotoxin (Krieg, 1986). Die insektizide Wirkung geht von den Proteinkristallen (crystal proteins) aus. Die Cry-Proteine kristallisieren waehrend der Sporulation im Sporangium aus. In diesem Zustand sind sie noch inaktiv. Nach oraler Aufnahme von Insekten werden sie im Mitteldarm durch Loesung im alkalischen Milieu (pH>9) and anschliessender Proteinverdauung aktiviert. Das aktive Cry1Ab-Protein bindet an Rezeptoren auf dem Mikrovillisaum des Darmepithels des Mitteldarms der Insekten. Das Cry1Ab-Protein perforiert die Epithelmembran und infolge eines erhoehten Kationenaustausches zwischen Darminhalt und Epithelzellen kommt es zu einem gestoerten elektrischen Potential und eine Beeintraechtigung des Ionen- und pH-Gradienten. Die Epithelzellen quellen bis zum Platzen durch den erhoehten osmotischen Druck. Der Darminhalt gelangt in die Haemolymphe und das Insekt verendet nach wenigen Stunden an dieser Vergiftung (Abb. 3). Einige Insektenarten sterben nicht infolge einer Darmparalyse, sondern durch eine bakterielle Vergiftung nach Keimung der Sporen im Darm. Hier erfolgt der Tod nach 2 bis 7 Tagen (Gill et al., 1992).


Abbildung 3: Schema ueber die Wirkungsweise des Bt-Cry-Proteins (de Maagd, 2001)
(a) Nach Verdauung durch das Insekt loesen sich die Protein-Kristalle in der Magenfluessigkeit. (b) Proteasen spalten einen C-terminalen Bereich (violett) und einen N-terminalen Bereich (gelb) ab. (c) Das nun aktive Protein bindet an bestimmte Rezeptoren der Epithelmembran. (d) Es kommt zu einem strukturellen Umbau der Domaene I. Dies erlaubt es einem Zwei-Helix-Hairpin in die Membran zu inserieren.
(e) Die inserierten Toxine formen die Poren, wahrscheinlich als Oligomere.  

1.3.1. MON810 und dessen Wirkungsweise

Mais der Sorte MON810 (Monsanto) ist resistent gegen den Maiszuensler. Dies wurde durch die Integration des cry1Ab-Gens in das Maisgenom erreicht, was die Maispflanze dazu befaehigt das insektizid wirkende Cry1Ab-Protein zu produzieren. (Abb. 4)

Abbildung 4: Wirkung von gentechnisch veraendertem Mais auf den Maiszuensler
 
Das cry1Ab-Gen steht unter der Kontrolle eines 35S-Promotors. Das integrierte DNA-Fragment enthaelt ebenfalls einen aus Mais stammenden Bereich des hsp70-Introns. (Abb. 5)


Abbildung 5: Darstellung des integrierten DNA-Konstrukts von MON810 (nach Matsuoka et al., 2002)    

2. Studien am Lehrstuhl fuer Physiologie

2.1. Untersuchungen zur Futtermittelprozessierung

Auf Versuchsfeldern angebauter gentechnisch veraenderter Mais wurde zu Maiskobs verarbeitet und unter Laborbedingungen ebenfalls siliert. Daraufhin wurden DNA und Proteine isoliert. Unbearbeiteter Gruenmais wurde als Kontrolle verwendet. Untersucht wurden das Transgen (cry1Ab) und das Chloroplasten-Gen rubisco (ribulose-1,5-bisphosphat-carboxylase/-oxygenase).
Die nachweisbaren Laengen der untersuchten Genabschnitte wurden mit zunehmender Silierungsdauer immer kleiner. Nach 6 Tagen konnten Fragmente des rekombinanten cry1Ab nur noch mit einer Groesse von 420bp nachgewiesen werden (Abb. 6). Die Bruchstuecke stellen nur eine Aneinanderreihung von Nukleotidbausteinen dar, die sich ausser in der Sequenz in keiner Weise von den Bruchstuecken anderer DNA unterscheiden.

Abbildung 6: Zusammenfassung der maximal nachweisbaren Fragmentlaengen in Maissilage (Lutz et al., 2005)

Die Ergebnisse mittels ELISA zeigten eine Abnahme immunoaktiver Fragmente des Cry1Ab-Proteins in Maiskobs auf ca. 31% des Ausgangswertes im Gruenmais. (Abb. 7)


Abbildung 7: Abbau des Cry1Ab-Proteins in der Ganzpflanze und bei der Silierung (MON810)

2.2. Degradierung von DNA und Protein im Pansen von Rindern

In einem Versuch mit pansenfistulierten Rindern wurden Saeckchen mit Maissilage bzw. Gruenmais in den Pansen eingefuehrt und dort ueber einen bestimmten Zeitraum inkubiert. Nach bestimmten Zeitabstaenden wurden Proben entnommen und die rekombinante DNA bzw. das rekombinante Protein anaylsiert. Das Chloroplasten-Gen rubisco diente dabei als Kontrollgen. Nur kleine Fragmente von rubisco (431bp) und cry1Ab (211bp) konnten ueber den kompletten Zeitraum von 48h nachgewiesen werden. (Abb. 8)

Abbildung 8: Uebersicht ueber die maximal noch nachweisbaren Fragmentlaengen bei Gruenmais und Maissilage nach Inkubation im Pansen. 

2.3. Fuetterungsversuch mit Damwild - Nachweis von rekombinanter DNA

In einem Fuetterungsversuch mit 6 Hirschen (Dama dama) wurden je drei Tiere mit gentechnisch veraendertem Mais der Sorte MON810 gefuettert. Die anderen drei Tiere erhielten die isogene Vergleichssorte. Zu Versuchsbeginn wurde eine einwoechige Eingewoehnungsphase festgelegt. Anschliessend wurden die Tiere fuenf Wochen gefuettert und am Ende des Versuchs geschlachtet. Dabei wurden Gewebeproben von Muskel, Niere, Milz, Leber, Lymphknoten, wie auch Inhalte von Pansen, Labmagen, Duenndarm, Dickdarm und Blinddarm genommen und die genomische DNA isoliert. Diese wurde mittels PCR und Gelelektrophorese auf Fragmente von cry1Ab, 18S (Bestandteil der kleinen Untereinheit der eukaryotischen Ribosomen), zein (spezifisches Pflanzenprotein in Mais) und rubisco untersucht. Die Ergebnisse sind in Abb. 9 dargestellt.

Abbildung 9: Darstellung der untersuchten Gewebeproben und Proben des Gastrointestinaltraktes, n=6 (Guertler et al., 2007)  

2.4. Langzeitversuch - Fuetterung mit gentechnisch veraendertem Mais (MON810)

In einem Langzeitversuch ueber 25 Monate wurden moegliche Effekte einer Fuetterung von Rindern mit gentechnisch veraendertem Mais untersucht. Diese Studie fand in Kooperation mit der Bayerischen Landesanstalt fuer Landwirtschaft (Dr. H. Spiekers) in Grub und dem Lehrstuhl fuer Tierernaehrung (Prof. F. Schwarz) der Technischen Universitaet Muenchen statt. Dabei wurden 36 Rinder (Simmentaler Fleckvieh), auf 2 Gruppen aufgeteilt, und entweder mit einer auf MON810 basierten Ration oder mit einer auf der isogenen Vergleichssorte basierten Ration gefuettert. Monatlich wurden Blut-, Milch- und Kotproben genommen; alle zwei Monate wurden zusaetzlich Urinproben genommen. Der Abbau bzw. Verbleib der rekombinanten DNA bzw. des Cry1Ab-Protein war dabei Gegenstand der Untersuchungen des Lehrstuhl fuer Physiologie.
Die Bearbeitung der Proben und die Auswertung der Daten ist abgeschlossen. Der Bericht wurde am 24. Maerz 2009 dem Auftraggeber uebergeben und am 25. Maerz 2009 der Oeffentlichkeit vorgestellt (siehe oben). 

3. Stellungnahmen

Zusammenfassung   zum derzeitigen wissenschaftlichen Stand in Bezug auf Futtermittel aus gentechnisch veraenderten Pflanzen und der darauf basierenden Milcherzeugung

Kein Uebergang von gentechnisch veraenderten Komponenten aus Tierfutter in Milch

DNA ist Bestandteil der taeglichen Nahrung. Gentechnisch veraenderte DNA verhaelt sich im Verdauungsprozess der Milchkuh genauso wie nicht gentechnisch veraenderte Pflanzen-DNA. Es ist in der Wissenschaft gesichert und unstreitig, dass die Verfuetterung gentechnisch veraenderter Futtermittel an Kuehe nicht dazu fuehrt, dass sich die Milch dieser Kuehe von der Milch solcher Kuehe unterscheidet, die mit entsprechenden nicht gentechnisch veraenderten Futtermitteln gefuettert wurden. Anders lautende Studien liegen nicht vor.

In wissenschaftlichen Fuetterungsstudien, die nach international anerkanntem Standard durchgefuehrt wurden, konnten in der Milch keine Komponenten (weder als gentechnisch veraenderte DNA noch als resultierendes Protein) aus der gentechnischen Veraenderung der Futtermittel nachgewiesen werden. Die Futtermittel hierbei waren in der EU zugelassene gentechnisch veraendertes Soja bzw. gentechnisch veraenderter Mais. Die heutigen Untersuchungsmethoden fuer genetisches Material sind in der Lage, kleine Fragmente der DNA auch in sehr geringen Mengen zuverlaessig nachzuweisen.

Die Frage des Eintrages gentechnisch veraenderten Materials von aussen in die Rohmilch, d.h. nicht durch Verfuetterung, muss ausser Betracht bleiben, da dieser bei der Gewinnung der Milch zu vermeiden ist*.

gez.

Prof. Dr. Ralf Einspanier
Freie Universitaet Berlin
Institut fuer Veterinaer-Biochemie
Prof. Dr. Gerhard Flachowsky
Bundesforschungsanstalt fuer Landwirtschaft, Braunschweig
Institut fuer Tierernaehrung
Prof. Dr. Knut J. Heller
Bundesforschungsanstalt fuer Ernaehrung und Lebensmittel, Kiel
Institut fuer Mikrobiologie
Prof. Dr. Gerhard Jahreis
Friedrich-Schiller-Universitaet Jena
Biologisch-Pharmazeutische Fakultaet
Institut fuer Ernaehrungswissenschaften
Prof. Dr. Klaus-Dieter Jany
Bundesforschungsanstalt fuer Ernaehrung und Lebensmittel, Karlsruhe
Molekularbiologisches Zentrum
Prof. Dr. Dr. Heinrich H.D. Meyer
Technische Universitaet Muenchen
Wissenschaftszentrum Weihenstephan fuer Ernaehrung, Landnutzung und Umwelt
Lehrstuhl fuer Physiologie

*Der Nachweis von Spuren gentechnisch veraenderter Futtermittel in Milchproben, die im Auftrag der Hessischen Landesvereinigung fuer Milch und Milcherzeugnisse untersucht wurden, fuehrt nicht zu einer abweichenden Betrachtung. Es handelt sich um private, nicht unter  wissenschaftlichen Bedingungen gezogene Proben. Die Untersuchungsergebnisse sind aufgrund mangelnder Qualitaetssicherung bei der Probengewinnung wissenschaftlich nicht verwertbar. Der Auftraggeber wurde darueber zeitnah informiert.

Summary

Present scientific position on the use of approved genetically modified feeds and milk production

No transfer of genetically modified (GM) ingredients to milk

DNA is part of daily food. During the digestion process in a milk cow, genetically modified DNA of plants acts exactly like genetically non-modified DNA. It is secure and non controversial scientific knowledge that feeding of genetically modified feeding-stuffs to cows does not lead to milk being different from the milk of such cows that have been fed non genetically modified corresponding feeding-stuffs. There are no studies yielding contrary results.

Feeding-studies carried out in accordance with internationally recognized standards have shown that neither genetically modified DNA nor the protein from GM feeding-stuffs have been found in milk. The GM feeding-stuffs used in milk production were soy and maize, - both approved by the EU. Today’s analytical methods can detect tiny fragments of the DNA even in very small quantities.

The question of GM material entering milk from other routes i.e. not by feeding, is not considered as it must be avoided in the production of milk*.

gez.

Prof. Dr. Ralf Einspanier
Freie Universitaet Berlin
Institut fuer Veterinaer-Biochemie
Prof. Dr. Gerhard Flachowsky
Bundesforschungsanstalt fuer Landwirtschaft, Braunschweig
Institut fuer Tierernaehrung
Prof. Dr. Knut J. Heller
Bundesforschungsanstalt fuer Ernaehrung und Lebensmittel, Kiel
Institut fuer Mikrobiologie
Prof. Dr. Gerhard Jahreis
Friedrich-Schiller-Universitaet Jena
Biologisch-Pharmazeutische Fakultaet
Institut fuer Ernaehrungswissenschaften
Prof. Dr. Klaus-Dieter Jany
Bundesforschungsanstalt fuer Ernaehrung und Lebensmittel, Karlsruhe
Molekularbiologisches Zentrum
Prof. Dr. Dr. Heinrich H.D. Meyer
Technische Universitaet Muenchen
Wissenschaftszentrum Weihenstephan fuer Ernaehrung, Landnutzung und Umwelt
Lehrstuhl fuer Physiologie

*The detection of traces of genetically modified feeding stuffs in milk samples which were analysed on behalf of the “Hessische Landesvereinigung fuer Milch und Milcherzeugnisse” (Hessian State’s Organization for Milk and Dairy Products) does not alter this assessment. The samples were private ones and not drawn under scientific conditions. Due to the lack of quality assurance during sampling the results of the analysis cannot be taken into scientific account. The customer was informed accordingly without delay.

4. Glossar

BegriffErlaeuterung
DNADesoxyribonukleinsaeure
Traeger der genetischen Information bei Pro- und Eukaryoten. Die Abfolge der vier Basen (A = Adenin, T = Thymin, G = Guanin, C = Cytosin) definiert die Sequenz und damit den Informationsgehalt.
ELISAEnzyme-linked Immunosorbent Assay
ELISA bezeichnet ein immunologisches Nachweissystem fuer die Detektion immunaktiver Fragmente von Proteinen und niedermolekulare Verbindungen wie Hormone, Toxine und Pestizide. Hierbei macht man sich die Eigenschaft spezifischer Antikoerper zu Nutze, die an den nachzuweisenden Stoff (Antigen) binden. Antikoerper oder Antigen werden zuvor mit einem Enzym markiert. Die durch das Enzym katalysierte Reaktion dient als Nachweis fuer das Vorhandensein des Antigens.
GelelektrophoreseAnalytische Trennmethode fuer Nukleinsaeuren und Proteine. DNA-Fragmente und Proteine wandern ladungsabhaengig im elektrischen Feld durch ein Gel. Kleine Fragmente wandern schneller als groessere Fragmente, wodurch eine Trennung stattfindet.
GenEin Gen ist eine Untereinheit des Genoms und entspricht einem Funktionsabschnitt auf der DNA (siehe DNA). Dieser Abschnitt wird abgelesen (RNA) und kann dann in Proteine umgesetzt werden.
GenexpressionGesamtprozess der Uebersetzung der genetischen Information vom Gen zum Protein.
GVOGentechnisch veraenderte Organismen
GVO sind Organismen, deren Genom in einer Weise veraendert wurde, wie es unter natuerlich Bedingungen nicht vorkommt.
Immuno-PCRDie Immuno-PCR (IPCR) ist eine Abwandlung des ELISA. Dabei wird statt eines Enzyms ein kleines DNA-Fragment an den Detektionsantikoerper gebunden und mittels qPCR oder Gelelektrophorese detektiert. 
IntronIntrons sind Abschnitte eines Gens, die nicht fuer ein Protein codieren. Ein Gen kann bis zu 75% aus Introns bestehen.
IsogenIsogene Ausgangslinien sind die nicht-gentechnisch veraenderten Pflanzen, die zur Erzeugung der GVO-Pflanzen verwendet wurden. Diese Linien/Sorten unterscheiden sich nur durch die gentechnisch eingefuegten Genkonstrukte
MON810Gentechnisch veraenderte Maissorte der Firma Monsanto, die das Cry1A(b)-Protein produziert
PCRPolymerase-Kettenreaktion
Molekularbiologische Methode zur Vermehrung bestimmter DNA-Abschnitte ausserhalb der Zelle mittels hitzestabiler DNA-Polymerase und zwei Primern (siehe Primer).
qPCRQuantitative PCR
Die qPCR beruht auf dem Prinzip der PCR, allerdings erfolgt eine Quantifizierung der DNA mittels Fluoreszenz-Messungen. Die Fluoreszenz steigt dabei proportional zur DNA-Menge an.
PrimerKurze Nukleotidsequenz aus DNA oder RNA, die als Startpunkt fuer die DNA-Polymerase in der PCR (siehe PCR) dient.
PromotorDNA-Abschnitt vor dem Transkriptionsstartpunkt
Der Promotor dient als Bindestelle fuer die RNA-Polymerase und reguliert damit die Transkription.
ProteasenAuch Peptidasen
Proteasen sind Enzyme die Proteine oder Peptide spalten koennen. 
ProteinProteine sind die Makromolekuele, die zu den Grundbausteinen der Zellen gehoeren. Die Bausteine der Proteine sind die Aminosaeuren, die zu Ketten verbunden sind. Ab 100 Aminosaeuren spricht man vom Protein. Proteine verleihen der Zelle nicht nur Struktur, sie transportieren andere Stoffe, katalysieren chemische Reaktionen und erkennen Signalstoffe.
SporangiumDas Sporangium ist die Bildungsstelle der auf ungeschlechtlichem Wege entstehenden Sporen.
SporulationDie Sporulation beschreibt den Prozess der Sporenbildung bei Bakterien und Pilzen.
TransgenAls transgen werden hoehere Organismen bezeichnet, die durch Gentransfer eingebrachte, fremde DNA-Abschnitte tragen.
Transkription

Die Transkription ist das Umschreiben von DNA in RNA. Man unterscheidet dabei die mRNA (messenger-RNA), die tRNA (transfer-DNA) und die rRNA (ribosomale RNA). Die mRNA wird in der Translation in eine Aminosaeuresequenz uebersetzt, die sich dann zu einem Protein (siehe Protein) zusammensetzt.

5. Kooperationen

Wissenschaftszentrum Weihenstephan

  • Dr. R. Kuehn
  • Prof. O. Rottmann
  • Prof. F. Schwarz

Bayerische Landesanstalt fuer Landwirtschaft

  • Dr. H. Spiekers
  • Dr. B. Killermann
  • Dr. Martin Mueller
  • Kerstin Steinke

Bundesforschungsanstalt fuer Landwirtschaft (Braunschweig)

  • Prof. G. Flachowsky

Institut fuer Veterinaer-Biochemie - Freie Universitaet Berlin

  • Prof. R. Einspanier

6. Literatur zum Thema

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© Lehrstuhl für Physiologie 
    Dokumentation: Patrick Gürtler
    Letzte Änderung: 28.04.2015