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Forschungsaktivitäten 2011

I.    Laktationsphysiologie

II.   Reproduktionsbiologie

III. Lebensmittelsicherheit, Ernährung und Umwelt

IV.  Wachstumsphysiologie, myotrope Therapeutika und Anabolika

V.  Bioanalytik

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I. Laktationsphysiologie

Die gesamte phagozytäre Leistung von neutrophilen Granulozyten ex vivo und der Zusammenhang mit den Plasma IGF-1 Konzentrationen bei Milchkühen während der Transitperiode.
Ex vivo phagocytic overall performance of neutrophilic granulocytes and the relation to plasma insulin-like growth factor-I concentrations in dairy cows during the transition period.
Sander, A. K.1; Piechotta, M.1; Schlamberger, G.; Bollwein, H.1; Kaske, M.1; Sipka, A.2; Schuberth, H.J.2: J Dairy Sci. 94 (2011) 1762-1771
Eine beeinträchtigte Funktion der polymorphkernigen neutrophilen Leukozyten (PMNL) im geburtsnahen Zeitraum ist die Hauptursache für eine erhöhte Anfälligkeit gegenüberInfektionskrankheiten bei Milchkühen. Faktoren die die Funktion der PMNL dysregulieren sind weitgehend unbekannt. Der insulinähnliche Wachstumsfaktor (IGF-1) verstärkte die Funktion der PMNL in vitro. Ziel dieser Studie war es, die Einflüsse der Konzentrationen von IGF-1, ?-Hydroxybuttersäure und nicht veresterte freie Fettsäuren auf die Phagozytose Aktivität (PA, Anteil der lebenden PMNL) und die Phagozytose Kapazität (PK, mittlere Fluoreszenz Intensität der PMNL) mittels Durchflusszytometrie zu bestimmen. Antepartum (Wochen -3. -2, und -1; vor der Kalbung)waren die IGF-1 Plasmakonzentrationen hoch (80-110 ng/mL) ohne Unterschiede zwischen erstkalbigen und mehrkalbigen Kühen (n = 18 bzw. n = 41). Bis zur Kalbung (Woche 1) nahmen die Konzentrationen von IGF-1 ab. Postpartum (Wochen 2, 3 und 4; nach der Kalbung) blieben die Konzentrationen geringer als vor der Kalbung, wobei die Konzentrationen bei den erstkalbigen Kühen höher waren als bei den mehrkalbigen Kühen. Während der gesamten Studie war die PA bei den erstkalbigen Kühen konstant. Hingegen hatten die PMNL der mehrkalbigen Kühe eine signifikant erhöhte PA in den Wochen 2 und 3 verglichen mit der der erstkalbigen Kühe. Die PK nahm nur bei den erstkalbigen Kühen signifikant ab bis zur Woche der Kalbung, wobei die Zahl der PMNL deutlich höher war als bei den mehrkalbigen Kühen. Die Phagozytose Power (PP, ein Produkt aus PA und PK), aber nicht die gesamte phagozytäre Leistung (phagocytic overall performance POP, ein Produkt aus PA, PK und Zahl der PMNL) unterschieden sich zwischen den erstkalbigen und mehrkalbigen Kühen in der Woche 3 postpartum. Es gab bei der POP keine Unterschiede zwischen den erstkalbigen und mehrkalbigen Kühen außer in der Woche 4 postpartum. In beiden Gruppen stieg die POP in der Woche der Kalbung. Im Gegensatz zu ?-Hydroxybuttersäure, das schwach positiv korreliert war mit PA und PK in der Transitperiode (Wochen -3 antepartum bis 4 postpartum) bei den mehrkalbigen Kühen, zeigten die mehrkalbigen Kühe schwach negative Korrelationen bei der Zahl der PMNL, der PA, PP, POP und IGF-1 Konzentrationen in diesem Zeitraum. Bei den erstkalbigen Kühen waren in der Transitperiode nur PP und PK schwach negativ korreliert mit IGF-1. Erhöhte Plasma IGF-1 Konzentrationen standen in keinem Zusammenhang zur Phagozytose Funktion der bovinen Blut PNML ex vivo, so dass diese nicht als geeigneter Indikator für diese Funktion herangezogen werden können.

Bovines Kolostrum: Bestimmung der natürlich vorkommenden Steroidhormone mittels Flüssigkeitschromatographie-Tandemmassenspektroskopie (LC-MS/MS).
Bovine colostrum: determination of naturally occurring steroid hormones by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS).
Farke, C.3; Rattenberger, E.3; Roiger, S.U.3; Meyer, H.H.D.: Journal of Agricultural and Food Chemistry 59 (2011) 1423-1427
Das Anliegen dieser Studie war weitere Daten für endogen vorkommende Hormone in Lebensmitteln tierischer Herkunft zu erarbeiten. Da in Kolostrum höhere Estrogenkonzentrationen als in Milch zu erwarten sind, haben wir den Fokus auf Kolostrum gelegt. Zur Messung der endogenen Steroidhormone in der Fett- bzw. Nichtfettfraktion des Kolostrum sowie im Kolostrumpulver wurden die relevanten freien und konjugierten Estrogene (Estradiol-17
?, Estradiol-17?, Estron and Estriol), Androgene (Androstendion, 19Nor-androstendion, 19Nor-testosteron-17?, 19Nor-testosteron-17?, Testosteron-17?, Testosteron-17?) und Progesteron mit Hilfe der LC-MS/MS bestimmt. Die höchsten Konzentrationen wurden in der Fettfraktion mit 25,6 µg/L und 7,6  µg/L für Estron und Androstendion gefunden. Im Kolostrumpulver dominierten die konjugierten Estrogene, wobei Estron (5,5 µg/kg frei; 15,0 µg/kg konjugiert) höher war als Estradiol-17 ? (2,7 µg/kg frei; 7,5 µg/kg konjugiert) und Estradiol-17? (2,3 µg/kg frei; 3,3 µg/kg konjugiert). Weder 19Nor-Steroide noch Estriol wurden in den Kolostrumfraktionen oder im Kolostrumpulver gefunden.

 

Einflüsse auf Klauengesundheit und Tierhygiene einer Milchkuhherde nach Ausstattung des Betonbodens mit Gummimatten: Eine Fallstudie.
Changes in hoof health and animal hygiene in a dairy herd after covering concrete slatted floor with slatted rubber mats: A case study.
Ahrens, F.4; Platz, S.4; Link, C.4; Mahling, M.5; Meyer, H.H.D.; Erhard, M.H.4: J Dairy Sci. 94 (2011) 2341-50
Anliegen der Studie war den Einbau von Gummimatten in einem Laufstall mit Betonboden auf Klauengesundheit und sonstige Tierhygiene bei 44 Braunviehkühen zu untersuchen. Die Bewertungen erfolgten vor der Umstellung sowie 4 und 10 Monate nach der Umstellung. Die durchschnittliche Luftfeuchtigkeit erhöhte sich von 1,5 auf 1,7 g/m3. Die Befunde für Huferkrankungen, Hautläsionen, Sauberkeit der Tiere und des Bodens sowie für Ammoniak in der Luft waren nicht verändert. Schlussfolgernd ergibt sich, dass der Einbau von Gummimatten die Bewegungsaktivität der Tiere günstig beeinflusst, aber keine adversen Effekte auf die Stallbedingungen und die Tiergesundheit hat.

Vergleich der Genexpression nach Inokulation von E. coli oder S. aureus in primäre Milchdrüsenepithelzellen aus Milchkühen mit unterschiedlicher genetischer Prädisposition für die somatische Zellzahl.
Comparative expression profiling of E. coli and S. aureus inoculated primary mammary gland cells sampled from cows with different genetic predispositions for somatic cell score.
Brand, B.6; Hartmann, A.6; Repsilber, D.7; Griesbeck-Zilch, B.; Wellnitz, O.8; Kuhn, C.9; Ponsuksili, S.6; Meyer, H.H.D.; Schwerin, M.6,10: Genetics Selection Evolution 2011, 43:24
Im  Verlaufe des letzten Jahrzehntes wurden einige QTL (quantitative trait loci), welche Mastitis und somatische Zellzahl beeinflussen, identifiziert. Hier wurde eine genomweite Genexpressionsanalyse durchgeführt mit dem Ziel, Assoziationen zu einzelnen QTL zu erhalten.

Methodik: Primäre bovine Milchrüsenepithelzellen (pbMEC) wurden aus dem Euterparenchym von Kühen, die für hohe und niedrige Mastitisempfänglichkeit selektiert waren, gesammelt und kultiviert. Die Kulturen wurden mit hitzeinaktivierten euterpathogenen E. coli und S. aureus Stämmen beimpft, nach 1, 6 und 24 Stunden beprobt und die mRNA Expression mittels Micro-Array-Technologie erfasst.

Resultate: Vergleichende Analysen zeigen eine deutlich schnellere Antwort auf die Pathogenbeimpfung bei den weniger mastitisempfänglichen Tieren. Die Resultate deuten auf RELB (reticuloendotheliosis viral oncogene homolog B; Transkriptionsfaktor, der die Immunantwort mitregelt) als Kandidatengen in der Nähe des lokalisierten QTL.

Schlussfolgerung: Die Ergebnisse zeigen, dass Genexpressionsprofiling Optionen bietet, auch in in vitro Studien, die Mechanismen der Immunabwehr der Milchdrüse bei Tieren unterschiedlicher Mastitisanfälligkeit zu differenzieren.


Diurnale Melatoninmuster in Blut und Milch von Milchkühen.

Diurnal pattern of melatonin in blood and milk of dairy cows.
Castro, N.8,11; Spengler, M.; Lollivier, V.12; Wellnitz, O.8; Meyer, H.H.D.; Bruckmaier, R.M.8: Milchwissenschaft 66 (2011) 352-353
Ziel dieser Studie war, die diurnalen Veränderungen der Melatoninkonzentrationen im Blut von Milchkühen zu untersuchen. Blutproben und die gesamte Milch wurden stündlich für 24 Stunden im Juni (ca. 16 Stunden Tageslicht) von 12 Kühen gesammelt. In diesen Proben wurden die Melatoninkonzentrationen gemessen. Im Blut sowie auch in der Milch zeigten diese einen diurnalen Verlauf, mit hohen Konzentrationen während der Skotoperiode und niedrige Konzentrationen während der Photoperiode. Die durchschnittliche Konzentration von Melatonin im Blut lag bei 16,2 ± 2,3pg/ml während der Photoperiode (0800-2200h). Der Anstieg begann gegen 2100h und ein Plateau (16,0±4,4pg/ml) wurde um 2300h erreicht. Die höchsten Konzentrationen wurden um 0100h gemessen (25,4±5,6 pg/ml). Um 0700 waren die Melatoninkonzentrationen im Blut wieder auf die Ausgangswerte gesunken. Der Verlauf der Konzentrationen von Melatonin in der Milch ähnelte dem im Blut. Jedoch waren die Melatoninkonzentrationen in der Milch viel geringer als im Blut mit einem Konzentrationsmaximum von 2,9±0,6 pg/ml.

II.   Reproduktionsbiologie 

Die Expression von Thrombopoietin und seines Rezeptors während verschiedener physiologischer Stadien im Rinderovar.
The Expression of Thrombopoietin and its Receptor During Different Physiological Stages in the Bovine Ovary.
Sarkar, M.13; Schilffarth, S.; Schams, D.; Meyer, H.H.D.; Berisha, B.14: Reprod Dom Anim 46 (2011) 757-762
Die Bedeutung von Thrombopoietin (TPO) für die Ovarfunktion ist unbekannt. Deshalb wurde die Expression von TPO und seines Rezeptors (c-MPL) im bovinen Gelbkörper (CL) während verschiedener Phasen im Zyklus, während der Gravidität und in Follikeln untersucht mit Hilfe der RT-PCR und ELISA. Anstiege für beide Faktoren in der frühen und späten Lutealphase im Zyklus wurden nachgewiesen. Dagegen blieben die Werte im graviden CL konstant und damit unreguliert. In kleinen Follikeln (<10mm Durchmesser) wurde die höchste Expression für TPO/c-MPL in theca interna und Granulosa Zellen aufgezeigt. Es wird geschlussfolgert, dass beide Proteine als „physiologischer Filter“ im Rinderovar beteiligt sind, um proliferative Zellen von funktionsschwachen Zellen zu separieren und zu stimulieren und damit eine wichtige modulierende Rolle für die Ovarfunktion haben.

Die Metallopeptidasen MMP14 und MMP2 und der metallopeptidase Inhibitor TIMP2 nehmen an maternalen Umbauvorgängen in Vorbereitung auf die Trächtigkeit beim Rind teil.
Bovine endometrial metallopeptidases MMP14 and MMP2 and the metallopeptidase inhibitor TIMP2 participate in maternal preparation of pregnancy.
Ulbrich, S.E.; Meyer, S.U.; Zitta, K.15; Hiendleder, S.16; Sinowatz, F.17; Bauersachs, S.18, 19, Büttner, M.20; Fröhlich, T.19; Arnold, G.J.19; Reichenbach, H.-D.21; Wolf, E.18,19; Meyer, H.H.D.: Mol Cell Endocrinol. 332 (2011) 48-57
Eine erfolgreiche frühe Embryonalentwicklung in der Gebärmutter des Rindes hängt entscheidend sowohl von einer adäquaten maternalen Vorbereitung als auch von einer richtigen embryonalen Signalgebung ab. In dieser Studie untersuchten wir die Aktivität von Matrix Metallopeptidasen (MMP), die zu räumlichen und zeitlichen Umbauvorgängen in der Gebärmutterschleimhaut  (Endometrium) beitragen. Die deutliche Änderung der Expression von MMP2, MMP14 und des Metallopeptidase Inhibitors TIMP2 zwischen verschiedenen Phasen des östrischen Zyklus deutete auf eine endokrine Regulation hin. Eine Erhöhung des TIMP2 Proteins in der den Embryo umgebenden Flüssigkeit konnte während der Wachstumsphase der Trophoblastzellen des Embryos nachgewiesen werden. Das Expressionsmuster und die zelluläre Lokalisation korrelierten gut mit den angenommenen Auswirkungen der MMPs auf Freisetzung und Aktivierung von Zytokinen und Wachstumsfaktoren, die eine Zellwanderung, Differenzierung und Vaskularisation während dieser wichtigen Phase des embryonalen Wachstums koordinieren. Insbesondere könnte durch die nachgewiesene Aktivität von MMP2 die Verfügbarkeit von Wachstumsfaktoren, die für die Entwicklung des Embryos notwendig sind, ermöglichen. Die Anwesenheit eines 18 Tage alten Embryos in vivo und einer 8 Tage alten Blastocyste in vitro induzierte die endometriale TIMP2 mRNA-Expression. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass TIMP2 an einer sehr frühen lokalen maternalen Erkennung der Trächtigkeit beteiligt ist. Matrix Metallopeptidasen sind für Umbauprozesse des Endometriums notwendig, welches die Entwicklung des Embryos unterstützt.

Mechanismen zur Etablierung einer immunologischen Toleranz während der frühen Trächtigkeit beim Rind.
Immunological mechanisms to establish embryo tolerance in early bovine pregnancy.
Groebner, A.E.; Schulke, K.; Schefold, J.C.22; Fusch, G.23; Sinowatz, F.17; Reichenbach, H.D.21; Wolf, E.18,19; Meyer, H.H.D.; Ulbrich, S.E.: Reprod Fertil Dev. 23 (2011) 619-632
Die immunologische Erkennung und Akzeptanz des Embryos stellen eine Herausforderung für den mütterlichen Organismus dar. Das Ziel der vorliegenden Studie war es, Mechanismen der Immuntoleranz bei Rindern während der Trächtigkeit vor dem Zeitpunkt der Implantation zu analysieren. Eine Gruppe von Färsen wurde entweder mit tiefgefrorenem Sperma oder mit Seminalplasma besamt und 12, 15 oder 18 Tage nach der Brunst getötet. In diesem Zeitraum wächst die Oberfläche der den Embryo umgebenden Zellen von einigen mm auf bis zu 30cm an. Die Gebärmutter wurde zur Gewinnung von Embryonen gespült und die Gebärmutterschleimhaut für molekulare Analysen gewonnen. Die Genexpression der Indoleamine 2,3-Dioxygenase (IDO), welches das erste Enzym des Kynurenin-Signaltransduktionsweges darstellt, war 18-fach (p <0,001) häufiger im Endometrium von trächtigen im Vergleich zu nicht-trächtigen Tieren an Tag 18 vorhanden. Mittels Tandem-Massenspektrometrie konnte neben dem Rückgang von L-Tryptophan (P =  0,0008)  eine  Steigerung  der  L-Kynurenin-Konzentration  (p = 0,005) zwischen Tag 12 bis Tag 18 gemessen werden, was auf eine zunehmende IDO Aktivität hindeutet (p <0,03). In einem Kultur-Modell von Zellen der Gebärmutterschleimhaut zeigte sich eine Induktion der IDO-Expression durch das embryonale Erkennungssignal Interferon-?. Eine immunhistochemische Analyse ergab, dass weniger CD45-positive Leukozyten in der Zona basalis der Gebärmutterschleimhaut bei trächtigen Tieren vorhanden waren als bei den nicht-trächtigen Kontrollen. Die erhöhte Aktivität von IDO könnte daher die Verringerung des Vorkommens von Leukozyten in den trächtigen Tieren darstellen und könnte einen möglichen Mechanismus für den Schutz des semi-allogenen Embryos vor der maternalen Abstoßung bieten.

Die Entwicklungskompetenz von Eizellen in vivo ist nach intraovarieller Applikation von IGF-1 reduziert, jedoch nur in schlanken und nicht in adipösen superovulierten Milchkühen.
In vivo oocyte developmental competence is reduced in lean but not in obese superovulated dairy cows after intraovarian administration of IGF1.
Velazquez, M.A.24,25; Hadeler, K.-G.24; Herrmann, D.24;  Kues, W.A.24; Ulbrich, S.E.; Meyer, H.H.D.; Rémy, B.26; Beckers, J.-F.26; Sauerwein, H.27, Niemann, H.24: Reproduction 142 (2011) 41-52
Die vorliegende Studie untersuchte die Rolle von IGF-1 bei laktierenden schlanken und nicht laktierenden adipösen Milchkühen. Ein pg IGF-1 wurde in die Eierstöcke der Kühe appliziert, wobei diese Menge einerseits mit Aborten bei Frauen mit Polyzystischem Ovarialsyndrom (PCOS) in Verbindung gebracht worden ist, andererseits auch mit einer eingeschränkten Kompetenz boviner Oozyten in vitro assoziiert ist. Die mRNA- und Proteinexpression von ausgewählten Genen, die an der Apoptose, dem Glukosestoffwechsel und dem IGF-System beteiligt sind, wurden analysiert. Die Behandlung mit IGF-1 verminderte die Lebensfähigkeit von Embryonen nur in mageren Kühen, vergleichbar mit der Rate, die bei adipösen Kühen beobachtet wurde. Übergewichtige Kühe zeigten erhöhte Werte von IGF-1 und Leptin. Der bei mageren Kühen beobachtete nachteilige Effekt von IGF-1 in den Eierstöcken und die fehlende Wirkung bei übergewichtigen Kühen ähneln in gewisser Weise der Situation, die bei PCOS-Patientinnen beobachtet wird. Bei diesen ist die IGF-1 Bioverfügbarkeit bei Normalgewichtigen erhöht, hingegen bei adipösen Frauen verringert. Dies deutet darauf hin, dass das vorliegende Rindermodell nützlich sein könnte für die Untersuchung der Beteiligung von IGF-1 an PCOS.

Anstieg an essentiellen Aminosäuren in der Gebärmutterflüssigkeit während der Embryonalentwicklung beim Rind.
Increase of essential amino acids in the bovine uterine lumen during preimplantation development.
Groebner, A.E.; Rubio-Aliaga, I.28; Schulke, K.; Reichenbach, H.D.21; Daniel, H.28; Wolf, E.18, 19; Meyer, H.H.D.; Ulbrich, S.E.: Reproduction 141 (2011) 685-695
Aminosäuren sind von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung des Embryos vor der Implantation. Um Einblicke in die Anforderungen an Aminosäuren von Rinder-Embryos zu bekommen, haben wir die Zusammensetzung der Gebärmutterflüssigkeit untersucht. An den Tagen 12, 15, und 18 nach der Brunst wurde die Gebärmutter von trächtigen und nicht-trächtigen Färsen gespült, um darin 41 Aminosäuren und deren Derivate durch Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie nachzuweisen. Die Gebärmutterschleimhaut wurde für die quantitative PCR entnommen. Neben einem trächtigkeitsabhängigen Anstieg der essentiellen Aminosäuren fanden wir erhöhte Konzentrationen für die meisten nicht-essentiellen proteinogenen Aminosäuren. Histidin und der Peptid-Transporter SLC15A3 waren signifikant an Tag 18 der Trächtigkeit erhöht. Unsere Ergebnisse zeigen eine erhöhte Konzentration von Aminosäuren während der frühen Trächtigkeit an. Diese dienen höchstwahrscheinlich dazu, den Embryo während der Phase des rapiden Wachstums möglichst optimal mit Nährstoffen zu versorgen.

Die Aminosäurekonzentration in der Gebärmutterflüssigkeit ist vor der Implantation verringert bei Anwesenheit klonierter im Vergleich zu in vitro fertilisierten Embryonen beim Rind.
Reduced amino acids in the bovine uterine lumen of cloned versus in vitro fertilized pregnancies prior to implantation.
Groebner, A.E.; Zakhartchenko, V.18; Bauersachs, S.18, 19; Rubio-Aliaga, I.28; Daniel, H.28; Büttner, M.20; Reichenbach, H.D.21; Meyer, H.H.D.; Wolf, E.18, 19; Ulbrich, S.E.: Cell Reprogram. 13 (2011) 403-410
Eine optimale intrauterine Versorgung mit Aminosäuren ist von spezieller Bedeutung für die Entwicklung von Präimplantations-Embryonen beim Rind. Eine fehlerhafte Regulierung der Aminosäureversorgung könnte Aborte verursachen. Bei Kerntransferträchtigkeiten (Somatic cell nuclear transfer – SCNT) treten häufig übermäßiges Wachstum der Föten und Anomalien der Plazenta auf. Deshalb analysierten wir 41 Aminosäuren und Aminosäure-Derivate mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie in Gebärmutterflüssigkeiten von trächtigen Kalbinnen an Tag 18 der Trächtigkeit, die in vitro befruchtet wurden (IVF), oder denen SCNT Embryonen übertragen wurden. Beide, IVF und SCNT Embryonen, wurden unter identischen Bedingungen bis zum Embryotransfer kultiviert. Die Konzentrationen von mehreren Aminosäuren, insbesondere der verzweigtkettigen Aminosäuren, waren in der die Embryonen aus SCNT umgebenden Flüssigkeit verringert. Die mRNA Expression für den Aminosäuretransporter SLC7A8 war ebenfalls 2,4-fach niedriger in der Gebärmutterschleimhaut von SCNT Trächtigkeiten. O-Phosphoethanolamin (PETN) war 11-fach verringert in der Uterusflüssigkeit der Tiere, die Träger eines SCNT Konzeptus waren und deutet auf Veränderungen des Phospholipid-Stoffwechsels hin. Diese Befunde beweisen eine gestörte embryo-maternale Interaktion während der Präimplantation nach dem Transfer von SCNT Embryonen, die zu späteren Entwicklungsstörungen beitragen könnten. Die Regulation der Aminosäurekonzentration ist unabhängig vom wichtigsten embryonalen Trächtigkeitserkennungssignal Interferon-tau. Daher müssen weitere, bislang unbekannte wichtige Signalmoleküle daran beteiligt sein, ein adäquates Milieu für normale Wachstums- und Differenzierungsvorgänge zu ermöglichen.

Niedrige Plasma Progesteronkonzentrationen sind sowohl assoziiert mit einem verringerten Blutfluss zum Gelbkörper als auch mit einem größeren Durchmesser des dominanten Follikels bei Milchkühen.
Low plasma progesterone concentrations are accompanied by reduced luteal blood flow and increased size of the dominant follicle in dairy cows.
Lüttgenau, J.1; Beindorff, N.1; Ulbrich, S.E.; Kastelic, J.P.29; Bollwein, H.1: Theriogenology 76 (2011) 12-22
In dieser Studie wurde der Einfluss einer niedrigen Plasma-Progesteronkonzentrationen auf die Gelbkörper- und Follikelentwicklung sowie auf die Genexpression der Gebärmutterschleimhaut während zwei aufeinander folgender östrischer Zyklen untersucht.
Zusammenfassend wurde eine niedrige Progesteronkonzentration im Diöstrus mit kleinerer lutealer Größe, verringerter lutealen Durchblutung und größerem follikulären Durchmesser im Behandlungszyklus assoziiert, die aber nicht im nachfolgenden Zyklus erneut auftraten.

Die Progesteronkonzentration im Plasma während der Mitte der Gelbkörperphase ist abhängig von der Größe des Gelbkörpers, aber unabhängig vom lutealen Blutfluss sowie der lutealen Genexpression in laktierenden Milchkühen.
Plasma progesterone concentrations in the mid-luteal phase are dependent on luteal size, but independent of luteal blood flow and gene expression in lactating dairy cows.
Lüttgenau, J.1; Ulbrich, S.E.; Beindorff, N.1; Hönnens, A.1; Herzog, K.1; Bollwein, H.1: Anim Reprod Sci. 125 (2011) 20-29
Das Ziel der vorliegenden Studie war zu untersuchen, ob die Progesteronkonzentration im Plasma von Kühen von der Größe des Gelbkörpers, von dessen Blutfluss bzw. von der Genexpression in Gelbkörpergewebe anhängt. Um Zyklen mit hohen und niedrigen Progesteron-Konzentrationen zu erreichen, erhielten 20 Milchkühe entweder eine einfache Behandlung mit 25 mg Prostaglandin F (2?) (PGF (2?)) am Tag 4 (PG1), oder zwei Behandlungen (25 mg PGF (2?) jeweils) am Tag 4 im Abstand von 12 Stunden (PG2) des östrischen Zyklus. Neben Progesteron wurde die Fläche (LTA) und das Volumen (LTV) des Gelbkörpers sowie der absolute (LBF) und der relativ (rLBF) luteale Blutfluss am 9. Tag nach der Brunst bestimmt. Weiterhin wurde das relative luteale Progesteron (RLP 4) und die luteale mRNA Expression von wichtigen Rezeptoren angiogener, vasoaktiver und steroidogener Faktoren an Tag 11 (± 1) während zweier aufeinanderfolgender Ovarialzyklen quantifiziert. Die Ergebnisse zeigen, dass die Plasma-Progesteronkonzentrationen in der Mitte der Gelbkörperphase von der Größe des Gelbkörpers abhängt, aber unabhängig ist von seiner Durchblutung und auch keine Genexpressionsunterschiede auftreten.

III. Lebensmittelsicherheit, Ernährung und Umwelt

Einfluss von den Prebiotika Inulin und Laktulose auf das intestinale Immunsystem und das Blutbild von Kälbern.
Effects of the prebiotics inulin and lactulose on intestinal immunology and hematology of preruminant calves.
Masanetz, S.; Preißinger, W.21; Meyer, H. H. D.; Pfaffl, M. W.: Animal 5 (2011) 1099–1106
Präbiotika werden als potente Alternative zu Antibiotika in der Tierhaltung vorgeschlagen. Die vergärbaren Substanzen wie z.B. Inulin oder Lactulose wurden in dieser Studie verglichen, um das Immunsystem und die Tiergesundheit durch eine Modulation der Darmflora zu stimulieren. In dieser Kälberstudie wurden die positiven Wirkungen von Inulin und Lactulose auf die Darmgesundheit und Hämatologie untersucht. Beide Präbiotika verminderten signifikant die Thrombozyten im peripheren Blut. Nur Inulin konnte die Hämoglobinkonzentration und den Hämatokrit erhöhen. Insgesamt ist die Leukozytenzahl in der mit Lactulose behandelten Gruppe zurückgegangen, während beide Präbiotika tendenziell den Monozytenanteil senkten. Die Genexpressionsstudien ergaben, dass die mRNA Expression von Markergenen die im Zusammenhang mit Entzündungen im Darm steht, durch beide Präbiotika Diäten reduziert wurde, was auf einen verminderten inflammatorischen Status hindeutet. Als einziger Marker wurde die Expression von Interleukin 8 durch Lactulose in den mesenterialen Lymphknoten erhöht. Im Ileum konnte gezeigt werden, dass Proliferationsmarker durch Inulin erhöht wurden, während Apoptosemarker von beiden Präbiotika beeinflusst und erhöht wurden. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen eine deutliche Wirkung von Präbiotika auf intestinale Gesundheits- sowie Leistungsmarker.

Der Einfluss von polyphenolreichem Schweinefutter auf Blutparameter, bakterielle Kolonisierung und Markergenexpression in weißen Blutzellen von Ferkeln.
The Influence of Apple- or Red-Grape Pomace Enriched Piglet Diet on Blood Parameters, Bacterial Colonisation, and Marker Gene expression in Piglet White Blood Cells.
Sehm, J.; Treutter, D30; Lindermayer, H.31; Meyer, H.H.D.; Pfaffl, M.W.: Food and Nutrition Sciences 2 (2011) 366-376
Die Problematik der Antibiotikaresistenzen ist wieder ein sehr attraktives und aktives Thema in den Medien. Es entwickelte sich schleichend über die letzten Jahrzehnte und entstand durch den breiten Einsatz von Antibiotika in der Humanmedizin, Veterinärmedizin und als prophylaktischer Leistungsförderer in der Tierhaltung. Es erscheint sinnvoll, in der Tierernährung nach wirksamen und umweltfreundlichen Alternativen zu suchen, die das Immunsystem stabilisieren ohne gesundheitliche Risiken für Mensch und Tier. Ziel dieser Arbeit war es, alternative Futterzusätze in der Schweinefütterung zu testen. Ein besonderer Aspekt war die Verwendung natürlicher Reststoffe aus der Getränkeherstellung, Apfel- und Rotweintrester. Um Erkenntnisse über die Effekte von Apfeltrester und Rotweintrester auf das Immunsystem und das Wachstum in Ferkeln zu gewinnen, wurden im Rahmen dieses Forschungsvorhabens ein in vivo Versuch an Ferkeln durchgeführt. Der Schwerpunkt des Forschungsvorhabens bildete der in vivo Fütterungsversuch in Zusammenarbeit mit Dr. Lindermayer vom Institut für Tierernährung und Futterwirtschaft (LfL) in Grub. Im Fütterungsversuch wurden 78 Ferkel mit 3,5% TS Apfel- oder roter Traubentrester gefüttert. Als Beobachtungszeitraum wurden die Tage um den Absetztermin gewählt, da dort die meisten immunrelevanten Veränderungen in der Umwelt sowie beim Futterwechsel stattfinden und auch bekanntermaßen die meisten Ferkelverluste zu verzeichnen sind. Proanthocyanidine und Flavonoide, die beiden Unterfamilien der Polyphenole, sind stark in verschiedenen Früchten und Beeren sowie im Obsttrester konzentriert. Sie haben in vielen Publikationen unterschiedliche Wirkungen gezeigt. Positive Wirkungen gegen Krebs, Bakterien oder Viren sind beschrieben. Im Weiteren schreibt man ihnen immunmodulierende Effekte zu. In unsere Studie wurden immunrelevante Markergenexpressionen mittels RT-qPCR in den weißen Blutkörperchen gemessen, seine bakterielle Darmflora von der Entwöhnung bis drei Wochen nach dem Absetzen untersucht.
In Zusammenarbeit mit dem Lehrstuhl für Obstbau, TUM Weihenstephan (Prof. Treutter), konnten die wichtigsten Polyphenolvertreter im Futter, in Mageninhalten und im Chymus nachgewiesen werden. In den tierischen Organen und Geweben waren mittels sensitiver HPLC Analytik nur Spuren der Polyphenole nachweisbar. Flavan-3-ole (Catechin und Epicatechin) und Proanthocyanidine (B1, B2 und C1) wurden im Magen- und Darminhalt identifiziert und quantifiziert, während nur Spuren von diesen in verschiedenen Ferkelorganen nachgewiesen werden konnte.
Die beiden polyphenolreichen Fütterungen zeigten einen positiven Einfluss auf die Bakterienpopulationen im Colon. Die Fütterung mit Apfeltrester und rotem Traubentrester, erhöhte die Anzahl der absoluten Anzahl der Darmbakterien. In den mit Trester behandelten Gruppen wurden krankmachende E. coli Bakterienstämme mehr verdrängt, während sich die Anzahl der gesundheitsfördernden Laktobazillen erhöhte. C. perfringens war nicht nachweisbar.
Auch im Blutbild konnten unterschiedliche Effekte durch die Fütterungen gemessen werden. Die Ergebnisse des Blutbildes zeigten, dass die Leukozytenzahl in der Kontrollgruppe anstieg, was auf eine Aktivierung des Immunsystems hinweist. In den Behandlungsgruppen zeigten sich jedoch keine Veränderungen. Die Blutwerte, Hämoglobin und Hämatokrit, waren herunter reguliert in allen Gruppen gegenüber der Kontrollgruppe. In beiden mit Trester behandelten Gruppen konnten höhere Thrombozytenkonzentrationen im Blut bestimmt werden.
Signifikante Expressionsänderungen der Markergene (TNFalpha, NFkB, und Caspase 3) wurden in den weißen Blutzellen zwischen den unterschiedlichen Fütterungen gefunden, aber die Variabilität dieser Expression war sehr hoch. Wir schließen daraus, dass beide polyphenolreichen Fütterungen das Potential zur positiven Beeinflussung der Darmflora, der Blutwerte, und immunmodulierende Wirkungen relevanter Markergene im Ferkel besitzen.

Expression immunrelevanter Gene im Schwein unter dem Einfluss geringer Dosen an Deoxynivalenol (DON).
Expression of immune relevant genes in pigs under the influence of low doses of deoxynivalenol (DON).
Becker, C.32; Reiter, M.; Pfaffl, M.W., Meyer H.H.D., Bauer, J.32, Meyer, K.H.D.32: Mycotoxin Research 27 (2011) 287-293
Deoxynivalenol (DON) ist ein weit verbreitet vorkommendes Fusarientoxin und stellt eine potentielle Gefahr für die Tiergesundheit dar, vor allem für monogastrische Tiere wie Schweine. Abhängig von Dosis und Häufigkeit der Belastung hat DON eine modulierende Wirkung auf das Immunsystem. In der aktuellen Studie sollten die Auswirkungen einer chronischen Aussetzung gegenüber geringen Mengen an DON auf die Genexpression immunrelevanter Faktoren untersucht werden. Hierzu wurden 20 Schweine in eine Kontroll- und eine Behandlungsgruppe (n=10) eingeteilt. Die Behandlungsgruppe erhielt eine kontaminierte Ration mit einem DON Gehalt von 1.2 (Tag 1-41) bzw. 2.0 mg/kg (ab Tag 42). Während des Versuchsvorhabens wurden in definierten Abständen Blutproben gezogen, bei der Schlachtung nach Versuchsende wurden Darmproben (Ileum) entnommen. Die Genexpression verschiedener Immunfaktoren (u.a. Cytokine, Transkriptionsfaktoren) wurde mittels RT-qPCR bestimmt.
Die meisten signifikanten Veränderungen in der Genexpression ergaben sich an Tag 45 nach Erhöhung der DON-Dosis im Futter. Hierbei konnte eine down-Regulation von proinflammatorischen Faktoren (IL-1?, IL-8, TNF?) beobachtet werden, was auf einen dosisabhängigen immunsuppressiven Effekt von DON hindeutet.

Abbauverhalten von Cry1Ab Protein in einem Güllefeldversuch nach MON810 Maisfütterung von Milchkühen: eine quantitative Studie.
Fate of Cry1Ab protein in agricultural systems under slurry management of cows fed genetically modified maize (Zea mays L.) MON810: A quantitative Assessment.
Gruber, H.20; Paul, V.33; Guertler, P.20; Spiekers, H.31; Tichopad, A.; Meyer, H.H.D.; Müller, M.34: Journal of Agricultural and Food Chemistry 59 (2011) 7135-7144
Güllefeldversuch nach MON810 Maisfütterung von Milchkühen. Zur Quantifizierung des Cry1Ab in
der landwirtschaftlichen Prozesskette von der gentechnisch veränderten (GV) Maispflanze über Futtermittel, Gülle, Boden und Erntegut der güllebehandelten Flächen wurde ein validiertes ELISA System eingesetzt. Ausgehend von 23.7 µg Cry1Ab g-1 Trockensubstanz in GV Mais wurde ein starker Abfall der Cry1Ab Gehalte beobachtet. So wurden jeweils 2.6% und 0.9% der Cry1Ab Ausgangsgehalte aus GV Mais in Futtermitteln und Gülle nachgewiesen. Die Hälfte des in frischer Gülle nachgewiesenen Cry1Ab überdauerte die Güllelagerung über 25 Wochen. Nach Aufbringen der Gülle auf die Versuchsflächen wurde ein abschließender Abbau des Cry1Ab auf Gehalte unterhalb der Nachweisgrenze im Boden dokumentiert. Im Vergleich zum Gesamtprotein wies Cry1Ab eine höhere Abbaurate in den beobachteten landwirtschaftlichen Prozessen auf. Immunblotanalysen zeigten in allen untersuchten Probenmaterialien einen Abbau des 65 kD großen rekombinanten Cry1Ab Gesamtmoleküls in immunreaktive Fragmente geringerer Größe.

IV. Wachstumsphysiologie, myotrope Therapeutika und Anabolika

Das Potenzial von bovinem Vaginalabstrich für die Entwicklung von Biomarkern zur Analyse der missbräuchlichen Anwendung anaboler Substanzen.
The Potential of Bovine Vaginal Smear for Biomarker Development to Trace the Misuse of Anabolic Agents.
Riedmaier, I.; Reiter, M.; Tichopad, A.; Pfaffl, M.W.; Meyer, H.H.D.: Exp Clin Endocrinol Diabetes 119 (2011) 86-94
In einem Versuch mit Nguni Färsen wurde erstmals getestet, ob es möglich ist, den Einfluss einer Kombination aus den anabolen Steroiden Trenbolon Acetat plus Estradiol auf die Genexpression im Vaginalabstrich zu messen. Hierfür wurden 9 Tiere über 39 Tage mit dieser Kombination behandelt. 9 weitere Tiere dienten als unbehandelte Kontrolltiere. Vaginalabstrich wurde an verschiedenen Tagen der Behandlung genommen (vor Behandlungsbeginn, Tag 2, 16 und 39 der Behandlung). Unterschiede in der Genexpression verschiedener Kandidatengene zwischen den beiden Behandlungsgruppen wurde mit Hilfe von RT-qPCR bestimmt. Dabei wurden Unterschiede in der Expression des Steroid Rezeptors ERa, des Keratinisierungsfaktors CK8, der proinflammatorischen Interleukine IL-1a und IL-1b, der Wachstumsfaktoren FGF7, EGF, EGFR, IGF-1R, TGFa und LTF, des Onkogens c-jun und der Faktoren Aktinb und Ubiquitin 3 gefunden. Mit Hilfe der Principal Components Analyse (PCA) und der Hierarchischen Clusteranalyse (HCA) konnte unter Einbeziehung aller gemessenen Gene eine Trennung der beiden Behandlungsgruppen beobachtet werden.

Einfluss von anabol wirksamen Kombinationen aus einem Androgen und einem Estrogen auf biochemische Stoffwechselwege im uterinen Endometrium und Ovar des Rindes.
Influence of anabolic combinations of an androgen plus an estrogen on biochemical pathways in bovine uterine endometrium and ovary.
Becker, C.; Riedmaier, I.; Reiter, M.; Tichopad, A.; Groot, M.J.; Stolker, A.A.M.; Pfaffl, M.W.; Nielen, M.F.W.; Meyer, H.H.D.: Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology 125 (2011) 192-201
Die weiblichen Geschlechtsorgane (Uterus, Ovar) sind primäre Ziele steroidaler Geschlechtshormone. Es ist deshalb zu erwarten, dass die illegale Anwendung anaboler Steroide einen Einfluss auf physiologische Prozesse in diesen Organen hat. Ziel der Studie war es, unter dem Einfluss steroidaler Wachstumsförderer veränderte biochemische Stoffwechselwege zu finden, die möglicherweise als Biomarker genutzt werden können.  Zwei Versuche wurden durchgeführt an post-pubertären Ngunifärsen (n=18) beziehungsweise an prä-pubertären Kälbern der Rasse Holstein Friesian (n=20). Die Tiere der jeweiligen Behandlungsgruppen erhielten eine Kombination aus einem Androgen plus einem Estrogen. Unterschiede in der Genexpression zwischen Kontroll- und Behandlungsgruppen wurden mittels RT-qPCR gemessen. Hierbei konnten signifikante Unterschiede in verschiedenen Gengruppen (Rezeptoren, angiogene Faktoren, Proliferation, Apoptose und andere) detektiert werden. Viele Gene zeigten jedoch gegensätzliche Regulation bei post-pubertären im Vergleich zu prä-pubertären Tieren. Die biostatistische Auswertung der Daten mittels Hauptkomponentenanalyse (PCA) konnte nur bei den Ngunifärsen eine Trennung zwischen Kontroll- und Behandlungsgruppe aufzeigen. Anabole Steroide beeinflussen die Hormonsensitivität sowie Steroidsynthese und induzieren proliferative Vorgänge im weiblichen Reproduktionstrakt. Das Ausmaß ist jedoch abhängig vom Entwicklungszustand der Tiere. Bei post-pubertären Tieren stellen die Geschlechtsorgane eine vielversprechende Matrix für die Suche nach Genexpressionsbiomarkern zum Nachweis der illegalen Anabolikaanwendung dar.

Die Analyse des Transkriptoms als neuer Ansatz zur Entwicklung von Biomarkern für die Aufdeckung des Missbrauchs anaboler Steroidhormone.
The analysis of the transcriptome as a new approach for biomarker development to trace the abuse of anabolic steroid hormones.
Riedmaier, I.; Pfaffl, M.W.; Meyer, H.H.D.: Drug Testing and Analysis 3 (2011) 676-681
Dieser Artikel gibt eine Übersicht über die Ergebnisse der Physiologie Weihenstephan im Bereich der Entwicklung von Genexpressions Biomarkern für den Missbrauch anaboler Substanzen. Hierbei wurden verschiedene Gewebe in verschiedenen Spezies zur Analyse herangezogen. In Kombination mit biostatistischen Methoden stellen Genexpressions Biomarker potenzielle Werkzeuge für die Entwicklung neuer Nachweismethoden dar.

V.  Bioanalytik

Veränderungen im miRNA Expressionsprofil in der bovinen Leber unter dem Einfluss anaboler Steroide.
Changes in the miRNA profile under the influence of anabolic steroids in bovine liver.
Becker, C.32; Riedmaier, I.; Reiter, M.; Tichopad, A.; Pfaffl, M.W.; Meyer, H.H.D.: Analyst 136 (2011) 1204-1209
microRNAs (miRNAs) sind kleine nicht-kodierende RNA Moleküle, die durch Beeinflussung der Genexpression einen regulatorischen Einfluss auf viele zelluläre Prozesse (z.B. Proliferation, Immunantwort) haben. miRNAs zeigen ein spezifisches Expressionsmuster in einer Vielzahl humaner Erkrankungen (z.B. Krebs) und sind deswegen vielversprechende Biomarker in der klinischen Diagnostik. Die Idee, Biomarker zu nutzen, besteht auch in der veterinärmedizinischen Rückstandsanalytik, z.B. zum Nachweis der illegalen Anwendung wachstumsfördernder Anabolika. Um eine mögliche Eignung von miRNAs als Biomarker für eine Behandlung mit anabolen Steroiden zu testen, wurde ein Versuch mit 18 Ngunifärsen durchgeführt. 9 Tiere wurden mit einer anabolen Kombination aus Trenbolonacetat plus Estradiol behandelt. Die restlichen 9 Tiere dienten als Kontrollgruppe. Unter Verwendung eines qPCR Arraysystems wurde zunächst ein Screening auf die Expression aller bekannten miRNAs durchgeführt. Die Ergebnisse physiologisch relevanter Kandidaten wurden mittels RT-qPCR validiert, wodurch eine differentielle Expression von 11 miRNAs nachgewiesen werden konnte.
Durch Auswertung der Expressionsergebnisse von mRNA und miRNA in einer Clusteranalyse (principal components analysis, PCA) konnte eine deutliche Trennung von Kontroll- und Behandlungsgruppe erzielt werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine Kombination verschiedener transkribierter Ziel-RNAs (mRNA plus miRNA) eine vielversprechende Methode zur Etablierung eines Genexpressionsmusters als Biomarker zum Nachweis anaboler Steroide darstellen könnte.

Offenlegung der Primer- und Sondensequenzen - eine Klarstellung der MIQE Richtlinien.
Primer Sequence Disclosure: A Clarification of the MIQE Guidelines.
Bustin, S.A.35; Benes, V.36; Garson, J.A.37;  Hellemans, J.38, 39; Huggett, J.40, 41; Kubista, M.42, 43; Mueller, R.44;  Nolan, T.45; Pfaffl, M.W.; Shipley, G.L.46; Vandesompele, J. 38, 39; Wittwer, C.T.47, 48: Clin Chem. 57 (2011) 919-921
Die Veröffentlichung der MIQE Richtlinien (MIQE Guidelines) im Jahr 2009 durch Prof. S. Bustin und einem internationalen Expertenkreis hat sich als ein wichtiger Meilenstein in der Qualitätskontrolle der analytisch sehr wichtigen quantitative RT-PCR erwiesen. MIQE soll die Transparenz und damit die Reproduzierbarkeit der angewandten und veröffentlichten qPCR Tests durch detaillierte Mindestanforderungen verbessern. Die Resonanz aus der Wissenschaft, der forschenden Industrie, der PCR Reagenzienhersteller war insgesamt positiv. Neben viel Medienresonanz fand der Artikel Beachtung in Fachzeitschriften, Print- und Online-Medien sowie hohe Anerkennung bei wissenschaftlichen Tagungen. Bereits Ende 2011 konnten über 600 Zitate der MIQE Publikation gezählt werden, was einen überwältigenden Respons in der wissenschaftlichen Welt darstellt. Die MIQE Richtlinien wurden nie mit der Absicht eingeführt, einen unveränderlichen Standard zu konzipieren. Ziel war es, eine Leitlinie für den „gesunden Menschenverstand“ zu konzipieren, um die Aussagekraft der Ergebnisse zu stärken, die Reproduzierbarkeit zu verbessern und die Transparenz innerhalb der qPCR Community zu fördern. Die qPCR Methode an sich ist so breit gefächert und findet in jeglichen Forschungsbereichen Anwendung; es ist unmöglich, „einen“ generellen analytischen Standard zu generieren und in „einem“ Thesenpapier niederzulegen. Im Mittelpunkt der wissenschaftlichen Diskussion und der öffentlichen Kritik standen die Offenlegung der Primer- und Sondensequenzen bei diagnostischen Assays. In den meisten kommerziell genutzten diagnostischen qPCR Assays werden nicht die Primer- und/oder Sonden-Sequenzinformationen genannt, da die meisten Anbieter diese als wirtschaftlich sensible Informationen betrachten und deshalb diese Information schützen möchten. Daher schlagen wir für die Zukunft eine pragmatische Änderung der ursprünglichen Richtlinien vor: entweder die jeweiligen „Primersquenzen“ oder die
„PCR Amplikon Kontext Sequenz“ zu veröffentlichen. Dies sollte die nötige Transparenz sowie auch Eindeutigkeit liefern, die die MIQE Richtlinien vorgeben. Die MIQE Richtlinien schlagen "minimale Anforderungen" vor, was nicht immer "idealen Anforderungen" entspricht. Die ursprüngliche Vorgabe der vollständigen Offenlegung der Primer- und Sondensequenzen als "wesentlicher Bestandteil" bleibt unser Ideal, und wird weiterhin als wesentlicher Bestandteil einer veröffentlichten Studie empfohlen. Mehr Transparenz in der wissenschaftlichen Forschung ist immer besser, und das schließt auch die qPCR Primer- und Sondensequenzen mit ein. Dennoch, angesichts der wirtschaftlichen Interessen, hielten wir es für sinnvoll, die minimalen Anforderungen leicht zu modifizieren. Wir hoffen, dass diese „überarbeiteten MIQE Richtlinien" ihre Attraktivität und Universalität behalten werden, ohne die Bedeutung der MIQE als den qPCR Standard zu verwässern.

RefGenes – ein Softwaretool zur Identifikation geeigneter Referenzgene für die Normalisierung in der RT-qPCR unter Berücksichtigung des physiologischen Status.
RefGenes: identification of reliable and condition specific reference genes for RT-qPCR data normalization.
Hruz, T.49; Wyss, M.49; Docquier, M.50; Pfaffl, M.W.; Masanetz, S.; Borghi, L.51; Verbrugghe, P.52; Kalaydijeva, L.52; Bleuler, S.53; Laule, O.53; Descombes, P.50; Gruissem, W.51; Zimmermann, P.51: BMC Genomics 2011, 12:156
Die RT-qPCR ist der „goldene Standard“ für die Quantifizierung der mRNA Genexpression. Um unterschiedliche biologische Proben anzugleichen und die RT-qPCR Messungen zwischen den Proben zu normalisieren, verwenden die meisten Wissenschaftler endogene Referenzgene als interne
Kontrollen. Jedoch gibt es zunehmend Hinweise, dass die Expression der am häufigsten verwendeten Referenzgenen erheblich variieren kann, vor allem unter bestimmten physiologischen Konstellationen. Ziel war es, ein Softwaretool zu entwickeln, dass stabile und valide Referenzgene identifizieren kann und gleichzeitig die untersuchten physiologischen Zustände des Organismus berücksichtigt. Die Genevestigator Datenbank beinhaltet eine Vielzahl von normierten und gut annotierten Microarrays unterschiedlicher Experimente und kann die Expressionsstabilität der Gene in mehreren Organismen und/oder Geweben beschreiben. Die Ergebnisse zeigen, dass es im Allgemeinen keine universell stabile Referenzgene gibt. Die in der Literatur am häufigsten verwendeten Referenzgene weisen eine sehr hohe Abundanz auf, verglichen mit dem gesamten Transkriptom. In jedem biologischen Kontext existiert ein anderes stabil exprimiertes Genexpressionsmuster mit minimaler Varianz. Wir schlagen daher zur Normalisierung der RT-qPCR Daten studienspezifische Referenzgene vor. Die Validierung über mehrere Organismen zeigt, dass die Referenzgenkandidaten, die durch RefGenes vorgeschlagen werden, generell besser sind als häufig zitierte Referenzgene. RefGenes steht als Freeware Tool innerhalb Genevestigator bei www.genevestigator.com oder unter www.refgenes.org frei für akademische Wissenschaftler zur Verfügung.

Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) basierte Echtzeitmessung von dosisabhängiger Zytotoxizität induziert durch adenovirale Vektoren in einem IPI-2I Zellkultur Modell.
Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) based real-time measurement of titer dependent cytotoxicity induced by adenoviral vectors in an IPI-2I cell culture model.
Müller, J.; Thirion, C.54; Pfaffl, M.W.: Biosensors and Bioelectronics 26 (2011) 2000-2005
Rekombinante Virale Vektoren repräsentieren in verschiedenen biotechnologischen Anwendungen wie beispielsweise der RNA Interferenz weitverbreitete Werkzeuge zum Transfer von genetischem Material. Hinsichtlich einer exakten MOI Einstellung (multiplicity of infection) stellt die genaue und reproduzierbare Virentitration die Grundlage für alle folgenden Arbeitsschritte dar. Als notwendige Grundlage für die Studien in dieser Arbeit präsentieren wir eine neue auf quantitativer real-time PCR (qPCR) basierende Methode zur Bestimmung der Anzahl viraler Partikel. Hinsichtlich physiologischer Effekte stellt die Tatsache, dass die Anwendung viraler Vektoren oftmals toxische Effekte auf die jeweiligen Zielzellen hat, ein ständig begleitendes Problem dar. Zur Ermittlung der kritischen viralen Dosis, welche den Zelltod einleitet, haben wir einen Electric Cell-Substrate Impedance Sensing (ECIS) basierten Assay entwickelt. Mit Hilfe der ECIS-Technologie lässt sich mittels eines Arrays die Impedanzänderung eines Stromflusses durch das Zellkulturmedium auf nicht invasive Weise ermitteln, wodurch Effekte wie Zell-Anhaftung, Zell-Zell-Kontakte oder Zellteilung visualisiert werden können. Das Potential dieser Echtzeit Messmethode zeigen wir anhand eines in vitro Modells,  bestehend aus der porcinen ilealen Epithelzelllinie IPI-2I und einem Derivat des adenoviralen Transfectionsvektors Ad5. Unsere Studien zeigen einen klar Dosis abhängigen Zusammenhang (p<0.001) zwischen der applizierten Virenmenge und dem Grad an verursachtem Zelltod. Damit stellt unser Assay eine allgemein anwendbare Anwendung zur Bestimmung der nicht letalen Dosis, bezogen auf die jeweilige Transfektionsmethode dar. Selbstverständlich bietet dieser Assay darüber hinaus auch das Potential auf andere cytotoxikologische Fragestellungen übertragen zu werden.

Quantifizierungsrauschen in Einzel-Zell-Experimenten.
Quantification noise in single cell experiments.
Reiter, M.55; Kirchner, B.; Müller, H.56; Holzhauer, C.56; Mann, W.56; Pfaffl, M.W.: Nucleic Acids Research 39 (2011)  e124
In quantitativen Studien an Einzel-Zellen besteht der entscheidende Faktor aus der geringen Menge an vorhandenen Nukleinsäuren und den daraus resultierenden experimentellen Abweichungen. Zusätzlich reflektieren, aus heterogenen Geweben gewonnene, biologische Daten nicht das Expressionsverhalten jeder Einzel-Zelle. Diese Abweichungen können einerseits  aus der biologischen Varianz entstehen aber andererseits auch von außen durch den Versuchsaufbau eingeführt werden. Beides hat negative Effekte auf die resultierende Quantifizierung. Das Ziel dieser Studie ist die Erhöhung der Transparenz und Verlässlichkeit von quantitativen Einzel-Zell-Studien um den MIQE-Richtlinien auch auf Einzel-Zell-Ebene gerecht zu werden. Die technische Variabilität, hervorgerufen durch RT, Verdunstung, biologisches Material und qPCR, wurde mittels DNA und RNA Standards untersucht. Zweitens wurden die biologischen Expressionsvarianzen von GAPDH, TNF, Il-1? und TLR4 in einzelnen Lymphozyten gemessen. Der hier verwendete Quantifizierungsaufbau war sensitiv genug um einzelne Standard-Kopien und Transkripte in einer individuellen Zelle zu detektieren. Die größten Abweichungen entstanden durch RT, gefolgt von Verdunstung und pre-amplification. Die biologische Matrix und Analyse der qPCR hingegen verursachten nur geringe Variationen. Beide durchgeführten Studien demonstrieren eindrucksvoll die Heterogenität der Expressionsmuster in Einzel-Zellen und zeigen klar die Grenzen heutiger quantitativen Expressionsanalysen in Einzel-Zellen auf.

© Lehrstuhl für Tierphysiologie und Immunologie    

    Letzte Änderung: 29.10.2015

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