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Forschungsaktivitäten 2008:

I.    Laktationsphysiologie

II.   Lebensmittelsicherheit, Ernährung und Umwelt

III.  Reproduktionsbiologie

IV.  Bioanalytik

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I. Laktationsphysiologie

Staphylococcus aureus und Escherischia coli bewirken unterschiedliche mRNA Expressionsprofile von Cytokinen und Laktoferrin in Euterepithelzellen
Staphylococcus aures and Escherichia coli cause deviating expression profiles of cytokines and lactoferrin mRNA in mammary epithelial cells
Griesbeck-Zilch, B.; Meyer, H.H.D.; Kühn, Ch.; Schwerin, M.; Wellnitz, O.:
Journal of Dairy Science 91 (2008) 2215-2224
Pathogene Bakterien, die in die Milchdrüse einwandern, aktivieren eine komplexe Signalkaskade, die zum einen zur Aktivierung des unspezifischen Immunsystems und zum anderen zu Entzündungssymptomen führt. Eine besondere Rolle spielen dabei die Euterepithelzellen, deren mRNA Expression von Cytokinen und Laktoferrin untersucht wurden. Hierzu wurden diese Zellen von 28 erstlaktierenden Holstein-Friesian Kühen in Zellkultur angezüchtet und für 1, 6 und 24 Stunden mit hitzeinaktivierten gram-positiven (Staphylococcus aureus) und gram-negativen (Escherichia coli) Bakterien infiziert. Beide Bakterien bewirkten eine verstärkte mRNA Expression von Proteinen, die an der Pathogenerkennung beteiligt sind, z.B. Toll-like Rezeptoren und Nucleus-Faktor-k-B, wobei ein höherer Anstieg nach der Stimulation mit gram-negativen Bakterien gesehen wurde. Erstaunlicherweise zeigten aber die pro-inflammatorischen Cytokine Tumor-Nekrose-Faktor-alpha, Interleukine (IL) -1beta, IL-6, IL-8 und das Chemokin RANTES nach 1 Stunde eine höhere Expression durch die Stimulation mit Staphylococcus aureus als mit Escherichia coli. Nach 6 bzw. 24 Stunden kehrte sich diese Situation aber wieder um. Laktoferrin zeigte nach 1 Stunde eine höhere mRNA Expression durch die Stimulation mit E. coli als mit Staph. aureus, nach 24 Stunden wurde allerdings die höchste Expression bei der Stimulation mit Staph. aureus gemessen. Allein für Complement Faktor 3 konnte kein Unterschied in der mRNA Expression zwischen gram-negativen und gram-positiven Bakterien gefunden werden.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Euterepithelzellen eine wichtige Rolle in der unspezifischen Immunabwehr des Euters spielen. Die zumeist niedrigere mRNA Expression nach der Stimulation mit Staph. aureus könnte auch ein Grund für den häufig chronischen Verlauf dieser Infektion sein.

Individuelle Schwankungen von physiologischem und metabolischem Stress während der Erstlaktation bei Haltung unter gleichen Bedingungen
Individual variability in physiological adaptation to metabolic stress during early lactation in dairy cows kept under equal condition
Kessel, S.; Stroehl, M.; Meyer, H.H.D.; Hiss, S.; Sauerwein, H.; Schwarz, F.J.; Bruckmaier, R.M.:
Journal of Animal Science 86 (2008) 2903-2912
Die Studie wurde mit Hochleistungskühen durchgeführt, um die individuelle metabolische und endokrine Anpassungsfähigkeit an die Laktation unter gleichen Haltungs- und Fütterungsbedingungen zu untersuchen. 45 Kühe waren in die Studie eingebunden, die auf einem Forschungsbetrieb unter standardisierten, praxisorientierten Bedingungen durchgeführt wurde. Von zwei Wochen vor der Kalbung bis 14 Wochen nach der Kalbung wurden wöchentlich Blutproben gezogen, in denen die Zusammensetzung des Blutes sowie verschiedene Stoffwechselparameter und Hormone bestimmt wurden. Körpergewicht, BCS und Rückenfettdicke wurden ebenfalls wöchentlich erfasst. Milchmenge, Milchzusammensetzung, Futteraufnahme und Energiebilanz wurden dementsprechend nach der Geburt erfasst. Die Tiere wurden rückwirkend anhand der BHB Konzentration im Plasma in zwei Gruppen eingeteilt: Solche Tiere, die mindestens einmal einen BHB von >1mmol/l im Plasma hatten, galten als BHB-positiv (BHB+); solche, die immer unter diesem Schwellenwert lagen, entsprechend als BHB negativ (BHB-). Anhand dieser Klassifikation wurden NEFA und Glukosekonzentrationen vergleichend untersucht. Der Mittelwert für die errechnete Energiebilanz unterschied sich nicht zwischen den Gruppen (-22,2 MJ NEL/Tag ± 4,7 für die BHB+, -18,9 MJ NEL/Tag ± 4,9 für die BHB-). Für die BHB+ Kühe zeichnete sich ein deutlicherer Rückgang bei Körpermasse, BCS und Rückenfettdicke an (P <0,05). Für die durchschnittliche Milchmenge gab es keinen Unterschied zwischen den Gruppen. Die BHB+ Kühe hatten einen höheren Milchfett- und geringeren Milchproteingehalt (P <0,05), und somit auch einen höheren Fett-Eiweißquotienten (P <0,05) als die BHB- Kühe. Ansatz-weise konnten die Kühe also die negative Energiebilanz durch Regulieren der Leistung kompensieren. Die Azetonkonzentrationen in der Milch entsprachen den Konzentrationen im Blut. Während des Versuchszeitraumes waren die Konzentrationen an IGF-I und Leptin bei den BHB- Kühen höher als bei den BHB+ (P <0,05). Beim Vergleich der Reproduktions-parameter (erster Progesteronanstieg, Erstbesamungserfolg, Trächtigkeitsindex, Rast- und Güstzeit) konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen beobachtet werden. Die Ergebnisse zeigen auf Basis einer Vielzahl metabolischer und endokriner Parameter, dass es bei Kühen trotz vergleichbarer Energiebilanz eine beachtliche individuelle Variabilität in der Anpassungsfähigkeit an die Frühlaktation gibt.

Wie verhält sich die Kuh, wenn der Spaltenboden mit Gummiauflage beschichtet ist: Eine Fallstudie
What happens with cow behavior when replacing concrete slatted floor by rubber coating: A case study
Platz, S.; Ahrens, F.; Bendel, J.; Meyer, H.H.D.; Erhard, M.H.:
Journal of Dairy Science 91 (2008) 999-1004
Höhere Lebensleistung und verbesserte Tiergesundheit werden als Ziele in der Milchviehhaltung angestrebt. Diese Studie beurteilte das Verhalten in Abhängigkeit von der Bodenbeschaffenheit. Verglichen wurden Betonspalten mit solchen, die mit einer Gummiauflage beschichtet sind. Dazu wurden in einer Herde von 50 Brown Swiss Kühen Östrus (Aufsprungaktionen) und Hygieneverhalten (Lecken auf drei Beinen und Schwanzlecken) zuerst auf Betonspaltenboden und später auf Gummimatten mit Videoaufnahmen aufgezeichnet und ausgewertet. Photographien und Pedometerdaten wurden herangezogen, um Länge und Anzahl der Schritte und so das Laufverhalten zu beurteilen. Im Vergleich zum Betonspaltenboden waren Schrittlänge (58 ± 1 vs. 70 ± 1 cm; n=35) und Anzahl der Schritte pro Tag (4226 ± 450 vs. 5611 ± 495; MW ± SD; n=9) erhöht. Auf den Gummimatten wurden mehr Aufsprünge beobachtet (23 vs. 112). Hinfallen oder Ausrutschen gab es nur auf Betonspaltenboden (bei 19 von 23 Aufsprungaktionen). Lecken auf drei Beinen und Schwanzlecken war auf Gummibelag um bis zu 4 Mal häufiger zu beobachten (105 vs. 511 Beobachtungen). Insgesamt wurde also eine Verbesserung des Verhaltens beobachtet, wenn die Laufoberfläche mit einem Gummibelag beschichtet war. Unterschiede bei Brunst- und Hygieneverhalten wurden auf den Bodenbelag zurückgeführt.

II.  Lebensmittelsicherheit, Ernährung und Umwelt

Cholesterin hat eine große Aufmerksamkeit während der letzten Jahrzehnte gewonnen, als alles darauf hinwies, dass dieses Molekül eine zentrale Rolle in der Entwicklung von Arteriosklerose, Herz-Kreislauf-Krankheiten und das metabolische Syndrom hat. Diätetische Studien haben gezeigt, dass Milch und Milchprodukte die zweitwichtigsten Cholesterinquellen in der modernen Ernährung sind.  Es existieren große Unterschiede in der Milchcholesterinkonzentration zwischen Spezies, Rassen, Individuen und Zeitpunkte  innerhalb eines Laktationszyklus. Aber die konkreten physiologischen Mechanismen, die diese Menge regulieren, sind unbekannt.

Neuer spezifischer Enzym Immunoassay für den Nachweis von ABCA1 in humanem Gewebe und Zellen
A novel enzyme immunoassay specific for ABCA1 protein quantification in human tissues and cells
Paul, V.; Meyer H.H.D.; Leidl, K.; Soumian, S.; Albrecht, C.: Journal of Lipid Research 49 (2008) 2259-2267
Um das ABCA1 Protein (Steroidtransporter) in humanem Gewebe und in lysierten Fibroblasten nachweisen zu können, haben wir einen ELISA auf der Basis eines kommerziellen ABCA1 Peptides und eines

polyklonalen ABCA1 Antikörpers entwickelt. Der Assay hat ein Detektionslimit von 8 ng/well (0,08 mg/L) und einen Arbeitsbereich von 9-1000 ng/well (0,09-10 mg/L). Die Assay Effizienz und der klinische Nutzen
wurden anhand von arteriellem Gewebe (Arteria mesenterialis inferior) von 15 Kontrollpersonen und 44 Patienten mit arteriosklerotischen Plaques evaluiert. Die ABCA1 Protein Konzentrationen des Gewebelysats der
Patienten (n=24) waren signifikant niedriger, verglichen mit denen der Kontrollpersonen (n=5; 9,37 ± 0,82 vs. 17,03 ± 4,25 µg/g tissue; P<0,01).

Expression von ABC Transporter und deren Regulatoren im Euter während der Laktation und Trockenstehphase
Differential expression of ABC transporters and their regulatory genes during lactation and dry period in bovine mammary tissue

Farke, C.; Meyer, H.H.D.; Bruckmaier, R.M.; Albrecht, C.:
Journal of Dairy Research 75 (2008) 406-414
ABC Transporter sind im Eutergewebe exprimiert, aber ihre konkrete physiologische Rolle in diesem Organ ist unbekannt.

Das Expressionsprofil verschiedener Kandidatengene für den Steroltransport im laktierenden und nicht-laktierenden Euter wurde mittels quantitativer PCR untersucht. Eine erniedrigte Expression von ABCA1, aber eine erhöhte Expression von ABCA7, ABCG2, SREBP1 und alpha-Lactalbumin konnte während der Laktationsphase gefunden werden.

Futtermittelzusätze

Einfluss von antimikrobiell wirksamen Futterzusätzen auf die Mikrobiologie des Verdauungstrakts und Blutparameter von Absetzferkeln

Einfluss von antimikrobiell wirksamen Futterzusätzen auf die Mikrobiologie des Verdauungstrakts und Blutparameter von Absetzferkeln
Effects of antimicrobial feed additives on gut microbiology and blood parameters of weaned piglets
Kroismayr, A.; Schedle, K.; Sehm, J.; Pfaffl, M.W.; Plitzner, C.; Foissy, H.; Ettle, T.; Mayer, H.; Schreiner, M.; Windisch, W.:
Die Bodenkultur 59 (2008) 111-120
In einem Fütterungsversuch mit 120 Absetzferkeln (8 kg Anfangsgewicht) wurden 2 Futterzusatzstoffe (ätherische Öle aus Oregano, Anis und Zitrusfruchtschalen bzw. Avilamycin) mit einer unbehandelten Kontrollgruppe verglichen. Nach 50 Tagen Verfütterung verbesserten die ätherischen Öle numerisch den Gewichtszuwachs, Futterverzehr und Futterverwertung (+5%, +3% und -1%), während Avilamycin geringere Effekte aufwies (+1%, -1% und -2%). Am Versuchstag 22 wurden von den 3 Behandlungen jeweils 12 repräsentative Tiere geschlachtet und Blutproben sowie Chymusproben aus dem Ileum, Caecum und Colon entnommen. Die beiden Futterzusatzstoffe hatten keinen Einfluss auf das Blutbild, reduzierten jedoch die Gehalte an anaeroben und aeroben Keimen, flüchtigen Fettsäuren und Ammoniak im Chymus des Ileums, Caecums und Colons, sowie die Gehalte an biogenen Aminen im Caecum. Die pH-Werte und die Gehalte an Trockenmasse (T) in den untersuchten Darmabschnitten blieben unverändert, mit Ausnahme eines erhöhten T-Gehalts im Colon bei Verfütterung ätherischer Öle. Diese Befunde weisen darauf hin, dass die eingesetzten ätherischen Öle ähnlich dem Avilamycin eine antimikrobielle Aktivität in vivo aufweisen.

Effekt von Avilamycin und ätherischen Ölen auf die mRNA Expression von Apoptose- und Entzündungsfaktoren und auf die Darmmorphologie von Ferkeln
Effects of avilamycin and essential oils on mRNA expression of apoptotic and inflammatory markers and gut morphology of piglets
Kroismayr, A.; Sehm, J.; Pfaffl, M.W.; Schedle, K.; Plitzner, C.; Windisch, W.:
Czech Journal of Animal Science 53 (2008) 377-387
In dieser Studie wurde die Wirkungsweise eines phytogenen Futterzusatzstoffes, verglichen mit einem antibiotischen Leistungsförderer, bei Absetzferkeln untersucht. Dazu wurde ein Experiment mit 120 Absetzferkeln durchgeführt. Die Tiere wurden auf drei Versuchsgruppen aufgeteilt, deren Diäten sich im Gehalt an Futterzusatzstoffen wie folgt unterschieden: (1) negative Kontrollgruppe: keine potentiell leistungsfördernden Substanzen (z.B. Probiotika, Präbiotika, organische Säuren) in der Ration, (2) ätherisches Ölgemisch aus Oregano, Anis und Zitrusschalen im Futter (Produkt: Bimon® P.E.P., Biomin GmbH) und (3) antimikrobieller Leistungsförderer Avilamycin (Produkt: Maxus 100, Elanco).
Die Tiere erhielten drei verschiedene, der jeweiligen Wachstumsphase im Nährstoffgehalt angepasste Fertigfuttermischungen, also von Versuchstag 1 bis 7 ein Starterfutter, von Tag 8 bis 22 ein Absetzfutter und schließlich von Tag 23 bis Versuchsende (Tag 50) ein Aufzuchtfutter. Starter- und Absetzfutter enthielten in der phytogenen Futtergruppe 40ppm ätherisches Ölgemisch, das Aufzuchtfutter 20ppm. Alle Fertigfutter der positiven Kontrollgruppe enthielten 40ppm Avilamycin. Die Tiere wurden ad libitum mit Futter und Wasser versorgt. Die Tiere wurden in 40 Blöcke à 3 Tiere mit gleicher Abstammung (Wurf), gleichem Geschlecht und gleichem Gewicht eingeteilt.
Am 22. Versuchstag wurden je 12 repräsentative Tiere aus jeder Futtergruppe (entspricht 12 Blöcken à 3 Tiere) professionell geschlachtet. Aus den Schlachtkörpern wurden umfangreiche Proben von verschiedenen Geweben bzw. Chymus aus verschiedenen Abschnitten des Verdauungstrakts entnommen. Diese Proben wurden für weiterführende mikrobiologische, histologische und molekularbiologische Untersuchungen verwendet.
Mittels PCR–Technologie wurde das Vorkommen von bestimmten Markergenen (Proliferations-, Apoptose- und Entzündungsfaktoren) in einer Reihe von Geweben gemessen. Dabei zeigte sich, dass beide Futterzusatzstoffe Einfluss auf die Expression des Transkriptionsfactors NFkB und des pro-inflammatorischen Cytokins TNFalpha hatten. So wurde zum Beispiel in den ilealen Geweben der Tiere TNFalpha im Jejunumgewebe durch das Phytbiotikum und durch Avilamycin gesenkt. Das gleiche wurde in der Avilamycin-Gruppe verglichen mit der negativen Kontrollgruppe beim Ileumgewebe und in den weißen Blutzellen festgestellt. Der Apoptose-Faktor Caspase 3 wurde nur durch Avilamycin beeinflusst (erhöhte Werte im Colongewebe, tendenziell erhöhte Werte im Muskelgewebe und tendenziell gesenkte Werte im Milzgewebe).

Der Proliferations- bzw. Zellzyklus-Marker Cyclin D1 wurde in den beiden Gruppen mit Futterzusatzstoffen in der Ration in manchen Geweben (Colon, mesenterale Lymphknoten und Milz) weniger häufig exprimiert als in der negativen Kontrollgruppe. Im Vergleich zur negativen Kontrollgruppe senkte Avilamycin diesen Marker auch im Jejunumgewebe.
Beide Futterzusatzstoffe senkten tendenziell die Expression von IGF1 (Insulin like growth factor) im Ileumgewebe. Erhöhte IGF1 Werte wurden bei der phytogenen Futtergruppe im Nierengewebe und bei der Avilamycingruppe im Milzgewebe gemessen.
Bei den histologischen Untersuchungen des Darmgewebes zeigten sich mit einer Ausnahme keine Einflüsse beider untersuchten Futterzusatzstoffe auf die Länge der Darmzotten im Jejunum und Ileum bzw. auf die Tiefe der Crypten im Colon. Lediglich in der Avilamycingruppe wurden seichtere Crypten im Colon gemessen. Allerdings führten im Vergleich zur negativen Kontrollgruppe sowohl das Phytobiotikum (-32%) als auch Avilamycin (-28%) zu signifikant kleineren Peyer´schen Platten im Ileumgewebe.
Schlussfolgernd bleibt festzustellen, dass der untersuchte phytogene Futterzusatzstoff auf Basis ätherischer Öle und der antibiotische Leistungsförderer Avilamycin sehr ähnlichen Einfluss auf die untersuchten mikrobiologischen, histologischen und molekularbiologischen Parameter zeigen. Es wird daher vermutet, dass beim Absetzferkel die Wirkungsweise beider untersuchten Stoffe sehr ähnlich ist.

Effekt von unlöslichen Balaststoffen auf die Darmmorphologie und mRNA Expressionmuster von Entzündungen, Zellzyklus und Wachstumsmarkergenen bei Absatzferkeln
Effect of insoluble fibre on intestinal morphology and mRNA expression pattern of inflammatory, cell cycle and growth marker genes in a piglet model
Schedle, K.; Pfaffl, M.W.; Plitzner, C.; Meyer, H.H.D.; Windisch, W.:
Archives of Animal Nutrition 62 (2008) 427-438
Ballaststoffe beinhalten verschiedene chemische Substanzen (Gerüstsubstanzen und/oder Lignin). Grundsätzlich können Ballaststoffe in eine lösliche und eine unlösliche Fraktion unterteilt werden. Diese Stoffe modifizieren, jedoch auf unterschiedliche Art und Weise, verdauungsphysiologische und morphologische Vorgänge beim Monogastrier. In diesem Zusammenhang war es Ziel dieser Studie, die Effekte verschiedener unlöslicher Ballaststoffquellen (unterschiedlich im Ligningehalt) auf morphologische und immunologische Parameter am Modeltier Absetzferkel zu untersuchen. Dazu wurden 48 Absetzferkel (Kreuzungslinie Edelschwein x Pietrain) mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 8,3±1,6 kg nach Wurf und Geschlecht, in 12 Blöcke zu je 4 Tieren eingeteilt. Die Tiere jedes Blockes wurden einer von 4 Futtergruppen zugeteilt. Als Ballaststoffquellen dienten Weizenkleie (unlösliche Ballaststoffquelle mit hohem Anteil an unlöslichen Hemizellulosen) und die Pollen der chinesischen Gelbkiefer (pinus massoniana) (unlösliche Ballaststoffquelle mit hohem Ligningehalt). Die Supplementation wurde so gewählt, dass sich vergleichbare Gehalte an Ballaststoffen ergaben. Kontrolle: Keine Ballaststoffquelle zugesetzt, nur Basaldiet; +3% Weizenkleie (16g Ballaststoffe/kg Trockenmasse), +1,27% Pinienpollen (8g Ballaststoffe/kg Trockenmasse), +2,55% Pinienpollen (16g Ballaststoffe/kg Trockenmasse). Während der ersten sieben Tagen wurde ein Starterfutter (15,4 MJ ME/kg, 21,5% XP) und von Tag 8 bis zum Versuchsende (Tag 37) ein Aufzuchtfutter (14,4 MJ ME/kg, 18,2% XP) eingesetzt. Das Futter wurde ad libitum verabreicht.
Am 37. bzw. 38. Versuchstag wurde jeweils die Hälfte der Tiere ohne vorherige Nüchterung einzeln fachgerecht geschlachtet. Sofort nach Entnahme des Verdauungstrakts wurden Gewebeproben vom Magen, Jejunum, Ileum, Colon und den mesenterialen Lymphknoten entnommen, in Kryoröhrchen mittels flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C für molekularbiologische Analysen aufbewahrt. Ein anderer Teil dieser Proben wurde in einer Kochsalzlösung gewaschen und in Formalin bis zur automatischen Einbettung für morphologische Analysen zwischengelagert.
Beide Ballaststoffquellen erhöhten die Zottenlänge im Jejunum (Ø +10%) und Ileum (Ø +16%). Follikelgröße und -dichte in den Peyerschen Platten und mesenterialen Lymphknoten neigten zu einer Vergrößerung durch Weizenkleie. Dieser Effekt konnte aber nicht bei Pinienpollen beobachtet werden. Die Reaktionen auf die mRNA Expressionsraten waren ballaststoff- und gewebespezifisch: Weizenkleie bewirkte eine Aufregulation von NFkB im Magen und Jejunum. Zusätzlich wurden durch Weizenkleie noch TNFalpha und TGFß sowie Caspase3 im Jejunum verstärkt exprimiert. Im Ileum konnten keine Veränderungen beobachtet werden. Im Colon verursachten die Pinienpollen eine Abregulierung von NFkB, TNFalpha, TGFß, Caspase3 CDK4 und IGF1. In den mesenterialen Lymphknoten erhöhten sie die Expression von NFkB und TGFß.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass unlösliche Ballaststoffzusätze beachtlich zur Produktivität und zur gastrointestinalen Stabilität beim Absetzferkel beisteuern. Das Mosaik von Beobachtungen, erhoben aus verschiedenen methodischen Perspektiven, demonstriert, dass das Potential unlöslicher Ballaststoffe einen "eubiotischen" Zustand im Intestinaltrakt monogastrischer Tiere produziert. Des Weiteren wirkten sich diese Art von Ballaststoffquellen positiv auf Darmmorphologie, Immunsystem und in weiterer Folge auf Gesundheit sowie zootechnische Leistungen aus.

Gentechnisch veränderte Futtermittel

Verbleib der rekombinanten DNA und des Cry1Ab Proteins nach der Nahrungsaufnahme und Verbreitung des gentechnisch veränderten Mais im Vergleich zu Raps beim Damwild (Dama dama)
Fate of recombinant DNA and Cry1Ab protein after ingestion and dispersal of genetically modified maize in comparison to rapeseed by fallow deer (Dama dama)
Guertler, P.; Lutz, B.; Kuehn, R.; Meyer, H.H.D.; Einspanier, R.; Killermann, B.; Albrecht, C.: European Journal of Wildlife Research 54 (2008) 36-43
Seit Beginn des kommerziellen Anbaus von gentechnisch veränderten Pflanzen wurden viele Studien über den Verbleib der rekombinanten DNA und des Proteins an Nutztieren durchgeführt. Es gibt jedoch nur sehr wenige Informationen über den Verbleib bei Wildtieren. Ziel unserer Arbeit war es Einblicke über den Verbleib rekombinanter DNA und Cry1Ab-Proteins beim Damwild (Dama dama) zu erhalten. Außerdem wurden die Keimfähigkeit von Mais- und Rapskörnern nach der Ausscheidung untersucht. Die Untersuchungen wurden in zwei Experimente mit jeweils 11 bzw. 6 Tieren aufgeteilt. Im ersten Experiment wurden die Keimversuche durchgeführt, im zweiten wurde der Verbleib der rekombinanten DNA bzw. des Cry1Ab-Proteins untersucht. Die Tiere der Versuchsgruppe wurden mit gentechnisch verändertem Mais (Bt176, Syngenta International AG), Tiere der Kontrollgruppe mit konventionellem Mais gefüttert. Im ersten Experiment wurden täglich Kotproben genommen und gefundene Mais- und Rapskörner auf ihre Keimfähigkeit untersucht. Nach der sechsten Versuchswoche des zweiten Experiments wurden die Tiere geschlachtet, um Gewebeproben und Proben aus dem Gastrointestinaltrakt zu entnehmen. Weder in Darminhalten, noch im Kot, konnten keimfähige Maiskörner gefunden werden. Hingegen waren 18% der Rapskörner aus dem Kot keimfähig. Mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) konnte das cry1Ab-Gen in keiner Probe nachgewiesen werden. Auch das Cry1Ab-Protein konnte mittels ELISA bzw. Western Blot nicht nachgewiesen werden.
Das cry1Ab-Gen, wie auch das Cry1Ab-Protein, werden nach der Futteraufnahme im Magen-Darm-Trakt des Damwilds abgebaut. Ausgeschiedene Körner sind nicht keimfähig und führen daher nicht zu einer Streuung des gentechnisch veränderten Mais.

Entwicklung und Validierung eines sensitiven Enzyme Linked Immunosorbent Assay zur Beobachtung des Cry1Ab Protein im bovinen Plasma von Kühen,
die mit Bt-Mais (MON810) gefüttert wurden
Development and validation of a sensitive enzyme immunoassay for surveillance of Cry1Ab toxin in bovine blood plasma of cows fed Bt-maize (MON810)
Paul, V.; Steinke, K.; Meyer, H.H.D.: Analytica Chimica Acta 607 (2008) 106-113
Der Einsatz gentechnisch veränderter Futtermittel gewinnt vor allem bei Nutztieren immer mehr an Bedeutung. Daher ist es unerlässlich sensitivere Methoden zum Nachweis des Cry1Ab-Proteins zu entwickeln, um mögliche Effekte untersuchen und Aussagen über den Verbleib des Proteins machen zu können. Bisher gab es keinen kommerziell erhältlichen ELISA zur Detektion immunoaktiver Fragmente des Cry1Ab-Proteins in bovinem Blut, der nach den Kriterien der EU Kommissionsrichtlinie 2002/657/EC validiert war. Daher wurde von uns ein sensitiver ELISA für die Detektion von Cry1Ab-Protein in bovinem Blut entwickelt und gemäß der Richtlinie validiert. Der analytische Messbereich dieses Assays liegt bei 0,4-100ng/mL mit einem CCalpha von 1,5ng/mL und einem CCbeta von 2,3ng/mL. Die Wiederfindungsrate beträgt durchschnittlich 98%. Dieser Assay wurde angewendet, um den Verbleib des Cry1Ab-Proteins im Blut von 15 Rindern zu untersuchen, die entweder mit gentechnisch verändertem Mais (MON810) (n=8) oder der nicht veränderten Vergleichssorte (n=7) über zwei Monate gefüttert wurden. Die ELISA-Ergebnisse für alle Proben lagen unter dem CCalpah von 1,5ng/mL. In keiner Probe konnte ein immunoaktives Fragment des Cry1Ab-Protein nachgewiesen werden.

III. Reproduktionsbiologie

Dynamische Veränderungen der RNA Botenprofile in der Gebärmutterschleimhaut des Rindes während des östrischen Zyklus
Dynamic changes of messenger RNA profiles of bovine endometrium during the oestrous cycle
Mitko, K.; Ulbrich, S.E.; Wenigerkind, H.; Sinowatz, F.; Blum, H.; Wolf, E.; Bauersachs, S.:
Reproduction 135 (2007) 225-240
Gestagene, Oestrogene und Oxytocin führen während des östrischen Zyklus zu charakteristischen morphologischen und funktionellen Veränderungen in der Gebärmutter-schleimhaut des Rindes. In einer umfassenden Studie des Trankriptoms wurden 269 Gene aufgezeigt, die an fünf definierten Zeitpunkten vor allem während des Östrus und des Diöstrus signifikant höher oder niedriger reguliert waren. Eine kleine Gruppe von Genen war auch 3,5 Tage nach dem Östrus aufreguliert. Die Zuordnung der Gene zu Genontologie-Kategorien verdeutlichte die Bedeutung des Umbaus der Extrazellulären Matrix für die Gebärmutterschleimhaut, des Transports und des Zellwachstums besonders während des Östrus. Im Diöstrus traten Gene hervor, die an der Immunantwort und an spezifischen metabolischen Stoffwechselwegen beteiligt sind. Die Erstellung von Geninteraktionsnetz-werken machte deutlich, dass Gene an der Regulation der Angiogenese, der Regulation von invasivem Wachstum und der Zelladhäsion im zyklischen Auf- und Umbau von Bedeutung sind.

Transkriptomstudien der Rindergebärmutterschleimhaut verdeutlichen molekulare Profile der Spezies-spezifischen Charakteristika des östrischen Zyklus und der frühen Gravidität
Transcriptome studies of bovine endometrium reveal molecular profiles characteristic for specific stages of estrous cycle and early pregnancy
Bauersachs, S.; Mitko, K.; Ulbrich, S.E.; Blum, H.; Wolf, E.:
Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes 116 (2008) 371-384
Während des östrischen Zyklus und der Gravidität finden funktionelle Veränderungen in der Schleimhaut der Gebärmutter, dem Endometrium, statt. Das Endometrium bildet die Kontaktstelle zwischen Embryo und Mutter, und eine intakte embryo-maternale Kommunikation ist von entscheidender Bedeutung für die Aufrechterhaltung der Gravidität. Umfassende Transkriptomstudien ermöglichen die ganzheitliche Erfassung von molekularen Fingerabdrücken, die aufgrund von endokrinen und metabolischen Stimuli oder embryonalen Erkennungssignalen variieren. In diesem Übersichtsartikel werden aktuelle Techniken der Erfassung des Transkriptoms vorgestellt und die Ergebnisse einer Reihe von Studien zur Veränderung des bovinen Endometriums im Zyklus und in der Frühgravidität zusammengefasst. Spezifische charakteristische mRNA-Profile des Endometriums zeigen, dass während der Frühgravidität Immunmodulatoren, Zelladhäsionsgene sowie solche Transkripte, die an dem Umbau des Endometriums beteilig sind, besonders auffällig vertreten sind. Die Ergebnisse der bovinen Studien werden mit Analysen aus humanen Studien sowie Studien bei Mäusen und Rhesusaffen verglichen, um Parallelitäten der Regulation sowie Spezies-spezifische Besonderheiten herauszustellen.

Effekt des LH Gipfels auf die Regulation von VEGF, extrazellulären Matrixproteasen (ECMP) und ihren Inhibitoren in bovinen Follikeln
Effect of the luteinising hormone surge on regulation of vascular endothelial growth factor and extracellular matrix-degrading proteinases and their inhibitors in bovine follicles
Berisha, B.; Steffl, M.; Welter, H.; Kliem, H.; Meyer, H.H.D.; Schams, D.; Amselgruber, W.:
Reproduction, Fertilility and Development 20 (2008) 258-268

Ziel der Arbeit war die Auswertung von angiogenen Faktoren (VEGF Familie) und extrazellulären Matrixproteasen (ECMP) bzw. Mitglieder der Matrixmetalloproteasen (MMP) und Plasminogen Aktivatoren (PA) in zeitlich definierten Follikelproben, die vor und nach dem LH Gipfel sowie nach der Ovulation gewonnen wurden. Es wurden folgende Faktoren untersucht: Angiogene Faktoren (VEGF-A Isoformen 121, 165, 189, VEGF-R1 und VEGF-R2); ECMP (MMP-1, MMP-2, MMP-14, MMP-19, TIMP-1, TIMP-2, tPA, uPA, uPAR und PAI-1). Um genügend Gewebematerial für die Studien an Follikeln zur mRNA Expression, Proteinkonzentration und Proteinlokalisation zu erhalten, wurde eine Superovulation durchgeführt: Nach Induzierung der Ovulation wurden Follikel bzw. frische CL durch transvaginale Ovariektomie gewonnen (n=5/Gruppe). Die Follikel wurden in folgende Gruppen eingeteilt: (I) Vor GnRH Injektion; (II) 4h nach GnRH (während des LH Gipfels); (III) 10h; (IV) 20h; (V) 25h (während der Ovulation) und (VI) 60h nach GnRH (nach der Ovulation; CL Tag 2-3). Zur Charakterisierung der Follikelgruppen wurden die Konzentrationen von Östradiol, Progesteron, PGF2alpha und PGE2 in der Follikelflüssigkeit (FF) gemessen. Der komplexe Prozess der Angiogenese wird durch proteolytischen Abbau der extrazellulären Matrix (ECM) initiiert, bei dem Matrix Metalloproteasen (MMP) und Plasminogen Aktivatoren (PA) zusammen mit angiogenen Faktoren entscheidend für das Gefäßremodelling sind. Unsere Untersuchungen bestätigen und unterstützen die Hypothese, dass lokal produzierte ECMP (MMP und PA) und angiogene Faktoren wichtige regulierende Funktionen im Prozess der Angiogenese während Follikelendwachstum, Ovulation und CL-Anbildung übernehmen.

Expression des Fibroblasten-Wachstumsfaktor 10 und seines Rezeptors, dem Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor 2b im bovinen Corpus luteum
Expression of fibroblast growth factor 10 and its receptor, fibroblast growth factor receptor 2B, in the bovine corpus luteum
Castilho, A.C.; Giometti, I.C.; Berisha, B.; Schams, D.; Price, C.A.; Amorim, R.L. ; Papa, P.C.; Buratini, J.Jr.:
Molecular Reproduction and Development 75 (2008) 940-945

Bereits in früheren Untersuchungen konnten wir die Bedeutung der Mitglieder der FGF-Familie wie FGF1, FGF2 und FGF Rezeptoren (und ihre Isoformen) für die Ovarfunktion aufzeigen. In dieser Arbeit wurde ein neues Mitglied dieser Familie – FGF10 – und sein spezifischer Rezeptor FGFR2IIIb in verschiedenen Phasen des Zyklus (Tag 1-2, 3-4, 5-7, 8-12, 13-18 und >18) sowie in CL nach induzierter Luteolyse (0,5, 2, 4, 12, 24, 48, 64 h nach PGF2alpha Injektion) untersucht. Die Ergebnisse lassen eine wichtige Rolle des FGFR2IIIb Signalweges für das bovine CL während der strukturellen Luteolyse vermuten.

Expression und Lokalisation von Apelin und seinem Rezeptor APJ im bovinen Corpus luteum während Brunstzyklus und Prostaglandin F2alpha-induzierter Luteolyse
Expression and localization of apelin and its receptor APJ in the bovine corpus luteum during the estrous cycle and prostaglandin F2alpha-induced luteolysis
Shirasuna, K.; Shimizu, T.; Sayama, K.; Asahi, T.; Sasaki, M.; Berisha, B.; Schams, D.; Miyamoto, A.:
Reproduction 135 (2008) 519-525

Ziel dieser Arbeit war es, die Expression sowie die Proteinlokalisation von Apelin und APJ im CL des Rindes während des Zyklus (Tag 1-2, 3-4, 5-7, 8-12, 13-18 und >18) und nach der induzierten Luteolyse (0,5, 2, 4, 12, 24, 48, 64 h nach PGF2alpha  Injektion) zu charakterisieren. Die vorliegende Studie zeigt, dass Apelin und APJ in glatten Muskelzellen intralutealer Arteriolen lokalisiert sind und auf PGF2alpha in der Peripherie von bovinen CL der mittlutealen Phase reagieren. Daher scheint das Apelin/APJ-System als ein Regulator der intralutealen Arteriolen bei der Reifung des CL und der luteolytischen Kaskade bei der Kuh beteiligt zu sein.

Effekt der lokalen Neutralisation durch einen spezifischen Antikörper gegen den basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor oder Vaskulären-Endothelzellen-Wachstumsfaktor auf die Entwicklung des Corpus luteum bei der Kuh
Effect of local neutralization of basic fibroblast growth factor or vascular endothelial growth factor by a specific antibody on the development of the corpus luteum in the cow
Yamashita, H.; Kamada, D.; Shirasuna, K.; Matsui, M.; Shimizu, T.; Kida, K.; Berisha, B.; Schams, D.; Miyamoto, A.: Molecular Reproduction and Development 75 (2008) 1449-1456
Ziel dieser Arbeit war es, die Effekte von FGF2 und VEGF auf die Entwicklung des CL in vivo zu untersuchen. Dafür wurden spezifische Antikörper (AK) gegen FGF2 und VEGF verwendet. FGF2 Antikörper, VEGF Antikörper oder Gammaglobulinfraktion (Kontroll-gruppe) wurden durch Mehrfachinjektionen unter Ultraschallkontrolle direkt in das CL nach der Ovulation appliziert. Weitere Injektionen (1x pro Tag) folgten an den nächsten sieben Tagen. Die Kontrolltiere bekamen die Gammaglobulinfraktion von nicht immunisierten Kaninchen. Die direkte Applikationsform spart AK und vermeidet eventuelle systemische Effekte. Die Kühe wurden täglich bis zu Tag 8 des Zyklus mit Color-Doppler-Ultrasonographie untersucht und jeden Tag wurde Progesteron im Blut gemessen, um das CL-Volumen im Verhältnis zur Funktion zu ermitteln. Am Tag 8 wurden luteale Biopsieproben entnommen und die mRNA Expression von Genen, die in Verbindung mit der Progesteronsynthese (StAR) und Angiogenese stehen (VEGF und VEGF Rezeptoren, FGF und FGF Rezeptoren, Angiopoietine und Tie Rezeptoren), ermittelt. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass die lokale Neutralisierung von FGF2 oder VEGF signifikanten Einfluss auf CL-Volumen, Progesteronproduktion und mRNA Expression der untersuchten Faktoren hat. Dies unterstützt die Hypothese, dass FGF2 und VEGF die CL-Bildung und -Funktion kontrollieren.

Anwendung eines sensitiven Enzymeimmunoassay zur Testeronbestimmung im Blutplasma von Yaks (Poephagus grunniens L.)
Application of sensitive enzymeimmunoassay for determination of testosterone in blood plasma of yaks (Poephagus grunniens L.)
Sarkar, M.; Dutta Borah, B.K.; Meyer, H.H.D.; Prakash, B.S.:
General and Comparative Endocrinology 158 (2008) 240-244
Als Alternative zum Radioimmunoassay wurde ein einfacher, hoch sensitiver und schneller Enzymimmunoassay zur Bestimmung von Testosteron in Plasma von Yaks entwickelt. Dazu wurde eine Doppel-Antikörpertechnik verwendet, und Testosteron mit einem Horseradish-Peroxidase Enzymkomplex markiert. Die Wells der Mikrotiterplatte wurden mit affinitätsgereinigtem Ziegen-IgG-anti-Kaninchen-IgG beschichtet, welches hormon-spezifische Antikörper bindet. Der Enzymimmunoassay wurde mit 20µl Plasma in einer 1:10 Verdünnung mit einem Assay-Puffer durchgeführt. Die Testosteron Standardkurve reicht von 0,2 bis 200pg/well. Testosteron Standardkurven in Puffer zeigten einen parallelen Verlauf zu Verdünnungsreihen von Yak Plasma mit hoher endogener Testosteronkonzentration. Intra- und Interassay-Variationskoeffizienten wurden mit gepoolten Proben bestimmt und betrugen 5,24% und 8,54%.
Für die Wiederfindung von Testosteron in mit Aktivkohle gereinigten Plasmaproben, die mit bekannten Konzentrationen von Testosteron versetzt waren, ergab sich ein linearer Zusammenhang (r = 0,98). Für die biologische Validierung des Testosteronenzymimmuno-assays wurden die Blutproben 2 Stunden vor der Verabreichung von Gonadotropin Releasing Hormon (GnRH) und dann 24 Stunden lang im 2 Stunden Intervall genommen. 2 und 6 Stunden nach der GnRH Verabreichung nahmen die Konzentrationen an LH und Testosteron stark zu (p <0,01). Die Konzentration von Testosteron in adulten Yak Bullen lag bei 0,52 ± 0,09ng/ml. Insgesamt ist der in dieser Studie entwickelte EIA eine einfache, hoch sensitive, valide und zuverlässige Methode für den direkten Nachweis von Testosteron im Plasma von Yaks.

IV. Bioanalytik

Validation des lab-on-chip Kapillar-Elektrophorese-Systems für die totale RNA Qualität und Qualitätskontrolle
Validation of lab-on-chip capillary electrophoresis systems for total RNA quality and quality control
Pfaffl, M.; Fleige, S.; Riedmaier, I.: Biotechnology & Biotechnological Equipment 22 (2008) 829-834
Die Qualität und Reinheit von RNA sind wichtige Aspekte für den Erfolg RNA basierender Analysemethoden, wie Mikroarrays und real time qRT-PCR. Auf dem Markt sind derzeit zwei automatisierte Systeme erhältlich, mit welchen man die Qualität und Quantität von RNA bestimmen kann, der Experion (Bio-Rad Laboratories) und der 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). In dieser Studie wurden beide Systeme im Bezug auf die Reproduzierbarkeit, Vergleichbarkeit und die Sensitivität getestet, indem die Qualität und Quantität von RNA aus sechs Rindergeweben bestimmt wurde. Bei der Bestimmung der RNA Konzentration schnitt der Experion im Vergleich zum Bioanalyzer 2100 besser ab. Beide Systeme überschätzen die Konzentration bis zu 19-29% im Vergleich zur photometrischen Bestimmung. Bei der Bestimmung der RNA Qualität zeigten beide Systeme vergleichbare Reproduzierbarkeit. Mit der RNA Integrity Number (RIN) bietet der 2100 Bioanalyzer eine zusätzliche Möglichkeit die RNA Qualität zu beschreiben.

Vergleich unterschiedlicher Plattenmaterialien, Plattentypen und Verschlussmaterialien mittels real-time PCR
Effects of plate position, plate type and sealing systems on real-time PCR results
Reiter, M.; Pfaffl, M.:
Biotechnology & Biotechnological Equipment 22 (2008) 824-828
Die quantitative real-time PCR stellt heute die Routinemethode in vielen diagnostischen und molekularbiologischen Labors dar. Um die Effizienz und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu garantieren und die Varianz bei der quantitativen Analyse zu minimieren, sollten standardisierte Protokolle und kontaminationsfreie Verbrauchsmaterialien verwendet werden. Ziel dieser Studie war der Vergleich unterschiedlicher Plattenmaterialien, einerseits weiße mit transparenten 96er qPCR Platten zu vergleichen, als auch unterschiedliche Verschluss-materialien zu testen. Es wurde das vollständige Verschließen der Platten mittels „heat sealing“ mit einfacheren selbstklebenden Folien verglichen.

Es konnte klar gezeigt werden, dass weiße Platten eine bessere und sensitivere Quantifizierung ermöglichen und sich die Varianz um ca. 45% verringern läßt. Bei der zweiten Studie konnte bewiesen werden, dass das sog. „heat sealing“ zu reproduzierbareren Ergebnissen bei einfacherem Handling führt, und somit Randeffekte auf den 96er qPCR Platten vermieden werden können.

 

 

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    Letzte Änderung: 29.10.2015