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Forschungsaktivitäten 2006:

I.    Laktationsphysiologie

II.   Lebensmittelsicherheit, Ernährung und Umwelt

III.  Reproduktionsbiologie

IV.  ABC Transporter: Bedeutung in Human- und Tierphysiologie

V.   Bioanalytik 

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I. Laktationsphysiologie

Die Expression immunrelevanter Gene durch Milchdrüsenepithelzellen und deren Einfluss auf die Chemotaxis von Leukozyten als Antwort auf verschiedene Mastitis-Pathogene
Immune relevant gene expression of mammary epithelial cells and their influence on leukocyte chemotaxis in response to different mastitis pathogens
Wellnitz, O.; Reith, P.; Haas, S.C.; Meyer, H.H.D.: Veterinarni Medicina 51 (2006) 125-132
Verschiedene Pathogene induzieren unterschiedliche Infektionsverläufe in der Milchdrüse und rufen eine unterschiedliche Immunantwort hervor. In dieser Studie wurde die Immunreaktion des Milchdrüsenepithels auf die Mastitiserreger Escherichia coli, der vorwiegend akute, Staphylococcus aureus, der überwiegend chronische, und Streptococcus uberis, der beide Verlaufsformen von Mastitis verursacht, untersucht. Dazu wurden Epithelzellen aus boviner Milch von 6 Tieren isoliert und in der Zellkultur mit den abgetöteten Erregern oder deren Bestandteilen behandelt. Die Immunreaktion wurde mittels qRT-PCR durch die Erfassung von mRNA-Expressionsmustern verschiedener Immun-modulatoren erfasst. Zusätzlich wurde die Sekretion von Chemokinen durch die Epithelzellen auf die Diapedese von Immunzellen in die Milchdrüse mittels Chemotaxisassays untersucht, wobei die Wirkung der Zellkulturüberstände, der mit abgetöteten Bakterien behandelten Zellen, auf Blutleukozyten getestet wurde. Es konnte gezeigt werden, dass E. coli eine schnellere Immunantwort der Epithelzellen hervorruft als S. aureus, und Str. uberis eine besonders geringe Antwort induziert. Bei E. coli und S. aureus Behandlungen gleichermaßen konnte ein Einfluss der Epithelzellen auf die Chemotaxis der Leukozyten gezeigt werden. Die Ergebnisse zeigen, dass auch das milchbildende Epithel einen Einfluss auf die unterschiedliche Immunantwort, und somit wahrscheinlich den unterschiedlichen Krankheitsverlauf bei Infektionen mit verschiedenen Mastitiserregern, hat.

Zelldifferentialbild und mRNA Expression inflammatorischer Faktoren in Viertelgemelksfraktionen verschiedener Zellzahlniveaus beim Rind
Leukocyte populations and mRNA expression of inflammatory factors in quarter milk fractions at different somatic cell score levels in dairy cows
Sarikaya, H.; Schlamberger, G.; Meyer, H.H.D.; Bruckmaier, R.B.: Journal of Dairy Science 89 (2006) S. 2479-2486

Einfluss der Milchfraktion auf die Aussagekraft der somatischen Zellzahl
Importance of the sampled milk fraction for the prediction of total quarter somatic cell count
Sarikaya, H.; Bruckmaier, R.M.: Journal of Dairy Science 89 (2006) S. 4246-4250
Die somatische Zellzahl (SCC) der Milch ist einer der wichtigsten Parameter für die Beurteilung von Milchhygiene und -qualität. Diese umfasst alle Zelltypen in der Milch und ist daher ein entscheidender Indikator für die Aktivität der zellulären Immunabwehr des Euters sowie für Eutergesundheit und -physiologie. Da jeder Zelltyp seine eigene spezifische Aufgabe während der Immunantwort übernimmt, kann aus deren Verteilung in der Milch direkt auf den immunologischen Zustand des Drüsengewebes geschlossen werden. In den beiden Arbeiten wurde die Aussagekraft der SCC in Abhängigkeit der Milchfraktion betrachtet, gewertet und durch die Parameter Differentialzellbild und mRNA-Expression verschiedenster Faktoren ergänzt.

Eine Reihe von Untersuchungen wurde an verschiedensten Milchfraktionen durchgeführt, welche während der Routinemelkung unter bestimmten physiologischen Eutergesundheitszuständen gewonnen wurden. Dabei zeigte sich ein klarer Zusammenhang zwischen der differenzierten Zellzahl und der Immunologie des Eutergewebes. Milch von Eutern mit sehr niedriger Zellzahl verfügte über einen hohen Anteil an Lymphozyten und dementsprechend geringe Mengen an Makrophagen und polymorphkernigen Neutrophilen (PMN). Da die Immunantwort des Euters hauptsächlich durch letztere Zelltypen reguliert wird, kann hieraus auf eine signifikant verringerte immunologische Aktivität geschlossen werden. Zusätzlich erwies sich die genaue Definition der jeweiligen Milchfraktion als entscheidend, wenn eine Beurteilung der Milchqualität und des Eutergesundheitsstatus auf der Basis von Zellzahl und Zelldifferentialbild erfolgen soll. In diesem Zusammenhang kann sich sogar reines Vorgemelk in seiner Zusammensetzung extrem von Zisternenmilch unterscheiden.
Zusätzlich zur direkten visuellen Zellbestimmung wurden die mRNA-Expressionen verschiedener Entzündungsfaktoren in den einzelnen Milchfraktionen untersucht. Die dabei erhaltenen Ergebnisse untermauerten generell die Schlussfolgerungen des Zelldifferentialbildes, da erhöhte mRNA-Expressionswerte der jeweiligen Gene zusammen mit steigender Zellzahl auf eine höhere Aktivität der Immunzellen hindeuteten. Im Gegenzug unterstrichen sehr niedrige mRNA-Expressionswerte die verminderte Immunantwort in Eutervierteln mit sehr niedriger Zellzahl. Diese Ergebnisse deckten sich klar mit dem aus der Zellzusammensetzung erhaltenen physiologischen Gesamtbild.
Letztlich zeigen die erhaltenen Ergebnisse, dass die Zusammensetzung der Milchfraktionen in den unterschiedlichen Euterkompartimenten deutlich die Rolle der somatischen Zellen bei der Immunantwort widerspiegelt. Besonders die differenzierte Zellzahl ermöglicht wichtige Rückschlüsse, da jeder Zelltyp über seine eigene spezifische Funktion bei der Immunantwort verfügt. Weiterhin stellte sich heraus, dass die genaue Definition der gewonnenen Milchfraktion für die Aussagekraft der Gesamtzellzahl sowie die Beurteilung des Eutergesundheitszustandes von entscheidender Bedeutung ist.

Lokalisation und mRNA Expression von Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) 1 in der Rindermilchdrüse während Mammogenese, Laktogenese und Involution
Localization of fibroblast growth factor I (acid fibroblast groweth factor) and its mRNA in the bovine mammary gland during mammogenesis, lactation and involution
Sinowatz, F. ; Schams, D.; Habermann, F.1; Berisha, B.; Vermehren, M.1: Anatomia, Histologia, Embryologia 35 (2006) 202-207
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die mRNA und Protein Lokalisation von FGF1 für die Rindermilchdrüse während definierter Phasen der Mammogenese, Laktogenese, Galaktopoese und Involution zu untersuchen. Es wurde Milchdrüsengewebe von insgesamt 23 Tieren während der Mammogenese (vor und während der Gravidität), der Laktogenese, sowie der frühen, mittleren und späten Laktationsphase genommen. Von trockenstehenden, nicht graviden Kühen (n=7) wurden an vier verschiedenen Zeitpunkten (8h, 24h, 48h, 96-108h) nach dem Trockenstellen Proben gewonnen. Die mRNA Lokalisation von FGF1 wurde mittels in situ Hybridisierung und der Protein Lokalisation mittels Immunhistochemie untersucht. Die Ergebnisse der mRNA und Protein Lokalisation von FGF1 in der Rindermilchdrüse zeigten eine ausgeprägte und deutliche Lokalisation hauptsächlich in Epitelzellen der Milchgänge während der Mammogenese, sowie abfallende Konzentrationen im Zytoplasma von Alveolarzellen während der Laktogenese und insbesondere im Verlauf der Laktation. Bezüglich der Intensität der Expression von mRNA Protein konnte keine strikte Korrelation nachgewiesen werden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass FGF1 eine wichtige Rolle während der Milchdrüsenentwicklung und deren Funktion beim Rind spielen kann.

II. Lebensmittelsicherheit, Ernährung und Umwelt

Sicherheitsbewertung gentechnisch veränderter Futtermittel
Gentechnisch veränderte (GV) Pflanzen werden so gezielt hinsichtlich ihres artspezifischen genetischen Bauplans verändert, dass nunmehr neue Eigenschaften (insbes. Herbizid- oder Insektenresistenz) bzw. Leistungen ermöglicht werden. In den vergangenen 10 Jahren stieg die weltweite Anbaufläche von GV Pflanzen kontinuierlich bis auf 102 Mio. Hektar im Jahr 2006 an. Auf rund einem Viertel dieser Flächen (25,2 Mio. ha) wurde GV Mais geerntet, der vor allem an landwirtschaftliche Nutztiere verfüttert wird. Ziel unserer Forschungsarbeiten war es, vor dem Hintergrund der öffentlich geführten Diskussion über den Einsatz von GV Pflanzen in der tierischen Produktion, den zeitabhängigen Abbau sowohl von rekombinanter DNA als auch rekombinantem Protein zu verfolgen. Dabei lag der Schwerpunkt auf der Bestimmung der Degradationsprozesse bei der Herstellung von Futtermitteln und während der Verdauung im Pansen des Rindes mittels sensitiver Nachweismethoden.

Abbau von transgener cry1Ab DNA und Cry1Ab Protein in Bt-176 Mais während des Silierungsprozesses
Degradation of transgenic Cry1AB DNA and protein in Bt-176 maize during the ensiling process
Lutz, B.; Wiedemann, S.; Albrecht, C.: Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition 90 (2006) 116-123
Die Herstellung von Maissilage zur Verlängerung der Haltbarkeit von Futtermais ist in der Landwirtschaft von großer Bedeutung, da diese vorwiegend als Grundfuttermittel für Milchrinder eingesetzt wird. Einen Schwerpunkt unserer Untersuchungen bildete deshalb der Vergleich des Abbaus pflanzenspezifischer Chloroplasten-DNA (rubisco-Gen) mit dem Abbau rekombinanter DNA (cry1Ab-Gen) im Laufe des Silierungsprozesses mittels PCR-Methoden. Weiterhin wurden die Mengen und die Fragmentlängen des immunoaktiven Cry1Ab Proteins zu definierten Zeitpunkten bestimmt. Diese Studien erforderten den Anbau von GV-Mais und der konventionellen Vergleichssorte, die Ernte und die Verarbeitung zu Futtermittel (Silage) unter Laborbedingungen. Zu bestimmten Zeitpunkten erfolgte die Probennahme zur weiteren DNA- und Proteinanalyse. Mittels DNA-Fragmentlängenanalyse ergab sich im Untersuchungszeitraum von 61 Tagen ein wesentlicher Abbau sowohl des rubisco als auch des cry1Ab Gens. Die DNA-Fragmente waren nach einer Silierungszeit von zwei Monaten durch den Einfluss des niedrigen pH-Wertes und der mikrobiellen Aktivitäten auf eine Größe abgebaut (< 420 bp), die kleiner ist als die eines funktionsfähigen Gens. Ebenso zeigte sich im Laufe des Silierungsprozesses mit Hilfe des ELISA und Immunoblott-Verfahrens eine klare Degradation des Cry1Ab Proteins. Nach 61 Tagen der Silierung konnten 23,6 % der ursprünglichen Ausgangsmenge immunoaktiver Fragmente mittels ELISA detektiert werden. Das vollständige Cry1Ab Protein war nur während der ersten 8 Tage der Silierung nachweisbar.

Aus unseren Ergebnissen resultiert, dass die durch Nutztiere aufgenommene Menge von rekombinanter DNA und Cry1Ab Protein bei der Verfütterung von Maissilage deutlich geringer ist, als die Menge vor der Futtermittelprozessierung.unantwort, und somit wahrscheinlich den unterschiedlichen Krankheitsverlauf bei Infektionen mit verschiedenen Mastitiserregern, hat.

In situ Untersuchungen zum zeitabhängigen Abbau von rekombinanter DNA und Novel-Protein aus gentechnisch verändertem Mais im Pansen des Rindes
In situ studies on the time-dependent degradation of recombinant corn DNA and protein in the bovine rumen
Wiedemann, S.; Lutz, B.; Kurtz, H.; Schwarz, F.J.; Albrecht, C.: Journal of Animal Science 84 (2006) 135-144
Nachdem die Qualität der „Fremd“-DNA im Futtermittel bekannt war, bildete die Untersuchung der zeitabhängigen Fragmentierung und quantitativen Degradation des cry1Ab Gens und des Cry1Ab Proteins im Verdauungstrakt, insbesondere im Pansen des Rindes, einen weiteren Schwerpunkt. Zur Beantwortung dieser Fragestellungen diente eine in situ Technik an pansenfistulierten Rindern. Hierzu wurden mit GV und konventionellen Maisproben (gehäckselter Ganzpflanzenmais, Ganzpflanzenmaissilage) befüllte Nylonsäckchen in den Pansen der Rinder eingebracht und nach definierten Zeitabschnitten entnommen. Bereits nach kurzer Inkubationszeit zeigte sich ein deutlicher Abbau der DNA und des Proteins durch Nukleasen und Mikroorganismen des Pansens. Es kommt mit fortschreitender Verweildauer der Proben im Pansen zu einer starken Fragmentierung des cry1Ab Gens, so dass eine biologische Aktivität rekombinanter Gene im Gastrointestinaltrakt nicht mehr erkennbar ist. Auch das Cry1Ab Protein wird durch die Verdauungsvorgänge bereits nach kurzer Zeit zu kleineren Fragmenten abgebaut, die nur mittels immunologischer Methoden detektierbar sind.

Mit dieser Studie wurde zum ersten Mal am lebenden Tier parallel der Verlauf des Abbaus von pflanzlicher und transgener DNA und des rekombinanten Proteins in Abhängigkeit der Zeit gezeigt. Frühere Publikationen über das Abbauverhalten beim Rind und bei anderen Spezies waren Endzeitstudien, d.h. die Proben wurden nach der Schlachtung gewonnen. Somit können nun erstmalig, trotz der langen Retentionszeit des Futters im Pansen und der damit verbundenen Vermischung von Futter verschiedener Mahlzeiten nach Verfütterung von GV Mais Aussagen über das zeitabhängige Abbauverhalten getroffen werden.

Immunmodulatorische Wirkungen von Mykophenolsäure
Effects of mycophenolic acid on inosine monophosphate dehydrogenase I and II mRNA expression in white blood cells and various tissues in sheep
Dzidic, A.; Prgomet, C.; Mohr, A.; Meyer, K.; Bauer, J.; Meyer, H.H.D.; Pfaffl, M.W.: Journal of Veterinary Medicine Series A, 53 (2006) 163-169

Mykophenolsäure (MPS) zeigt immun-suppresive Wirkungen und wird deswegen in der Humanmedizin bei Organtransplantationen eingesetzt. In der Landwirtschaft trifft man es als ungewünschten Metabolit einiger Pilze in schlechten Silagen an. MPS kann das Schlüsselenzym Inosin Monophosphat Dehydrogenase (IMPDH) im Metabolismus hemmen. IMPDH das in zwei Subtypen vorkommt (IMPDH I und II), stellt das Schlüsselenzym in der de novo Synthese von Guanin Nukleotiden dar. Guanin Nukleotide sind die Bausteine der RNA sowie DNA und somit essentiell. Eine Inhibition von IMPDH geht mit einer starken Beeinflussung der RNA und DNA Syntheseleistung vor allem in Leukozyten einher. Ziel der Studie war es den langfristigen Einfluss von MPS auf die Expression IMPDH Subtyp I und II auf mRNA Ebene zu untersuchen.
Es wurden neun gesunde Schafe für 9 Wochen mit 300 mg MPS pro Tier und Tag behandelt und neun unbehandelten Schafen gegenübergestellt. Über die Behandlungszeit wurden kontinuierlich Blutproben (nach 1, 2, 4 und 9 Wochen) gezogen, und die Expression von IMPDH I und II bestimmt. Nach der Schlachtung der Tiere wurde die mRNA Expression in acht unterschiedlichen Organen (Lebe, Niere, Jejunum, Ileum, Milz, Thymus, mesenterialer und pharyngealer Lymphknoten) bestimmt. Mittels quantitativer real-time RT-PCR konnten die mRNA Expressionslevel der beiden Enzyme exakt und zuverlässig quantifiziert werden.
Es konnte gezeigt werden, dass IMPDH I nicht beeinflusst wurde, nur der Trend einer Abregulation konnte im pharyngealer Lymphknoten gezeigt werden. Der Subtyp II war signifikant im Ileum abreguliert, und Trends einer Abregulation konnte im Jejunum gezeigt werden. Auch in den Leukozyten, wurde über die 9 Wochen Behandlung eine Abregulation festgestellt.
Zusammenfassend ist zu sagen, das MPS immun-modulatorische Effekte auf den IMPDH Subtyp II in den Leukozyten und im Verdauungstrakt zeigt.

Wirkung von Laktoferrin auf die Käbergesundheit
Influence of bovine lactoferrin and lactoferricin on cytokine expression in LPS-treated cultivated bovine blood cells
Prgomet, C.; Peters, S.; Pfaffl, M.W.: Journal of the Science of Food and Agriculture 86 (2006) S. 640-647
Eine gesunde Kälberaufzucht ist die Basis für eine erfolgreiche und wirtschaftliche Nutzung bei der Kälber- und Rindermast, aber auch für eine leistungsorientierte Milchviehhaltung. Bedingt durch das zukünftige Verbot von Antibiotika bedarf es einer Neuorientierung zur Gesundheitsprophylaxe und Leistungsstabilisierung in der Kälberfütterung. Lactoferrin (LF) als Futterzusatzstoff und natürlicher Milchinhaltsstoff stellt eine Alternative mit darmstabilisierender Wirkung dar. LF ist ein eisenbindendes bioaktives Glycoprotein, das in zahlreichen in vitro- und in vivo- Untersuchungen anti-mikrobielle, anti-virale, anti-mykotische und immunmodulierende Eigenschaften bewiesen hat.

Ziel der Arbeit war es die Effekte des LF und eines bioaktiven Spaltproduktes das Laktoferricin (LFcin) hinsichtlich der Expression von inflammatorischen Markern in kultivierten Blutzellen (WBC) und isolierten Monozyten in unterschiedlichen physiologischen Konzentrationen zu untersuchen. LF und LFcin können LPS (Lipopolysaccharide) binden und deren Wirkung aufheben. Die Blutzellen wurden dementsprechend mit unterschiedlichen LPS Konzentrationen induziert und die zeitabhängige Zellantworten nach 0, 1, 2, 4 und 8 Stunden gemessen. Die Quantifizierung der mRNA Expression einiger inflammatorischer Marker-Zytokine (TNFa, IL-1b, IL-6, IL-10) und diversen Transkriptionsfaktoren (NFKB), sowie Wachstums- und Apoptosefaktoren erfolgte über eine quantitative one-step real-time RT-PCR.
LF, LFcin als auch LPS besitzen zell-aktivierende Fähigkeiten und konnten die Expression der meisten Zytokine aktivieren. Es konnte keine inhibitorischen Wirkungen von LF und LFcin auf LPS in der Monozyten- als auch WBC Zellkultur innerhalb 8 Stunden feststellt werden.

Stimulation der körpereigenen Immunabwehr: Effekte von sekundären Pflanzen-inhaltsstoffen auf die Leistung und das Immunsystem von Monogastriern
The influence of apple- and red-wine pomace rich diet on mRNA expression of inflammatory and apoptotic markers in different piglet organs
Sehm, J.; Lindermayer, H.; Meyer, H.H.D.; Pfaffl, M.W.: Animal Science 82 (2006) 877-887
Die Problematik der Antibiotikaresistenzen entwickelte sich schleichend über die letzten Jahrzehnte und entstand durch den breiten Einsatz von Antibiotika in der Humanmedizin, Veterinärmedizin und als prophylaktischer Leistungsförderer in der Tierhaltung. 2004 wurden 6% der verwendeten Antibiotikummenge als antibiotische Leistungsförderer in der Landwirtschaft eingesetzt, das entsprach fast 800 Tonnen in Europa. Durch die Anwendung von antibiotischen Leistungsförderern werden höhere Wachstumsraten und geringere Mortalitätsraten bei Jungtieren erzielt. In der EU sind Antibiotika als Leistungsförderer in der Tierernährung seit dem 1. Januar 2006 (Verordnung EG Nr. 183/2003 Artikel 11 Absatz 2) verboten.

Ziel dieser Arbeit war es, alternative Futterzusätze zu testen, die die Gesundheitsstörungen vermindern oder ganz vermeiden. Ein besonderer Aspekt war die Verwendung natürlicher Reststoffe aus der Getränkeherstellung, Apfel- und Rotweintrester. Um Erkenntnisse über die Effekte von Apfeltrester und Rotweintrester auf das Immunsystem und das Wachstum in Ferkeln zu gewinnen, wurden im Rahmen dieses Forschungsvorhaben verschiedene in vitro und in vivo Versuche durchgeführt. In einem ersten in vitro Vorversuch wurde mit primären weißen Blutzellen gearbeitet. Die kultivierten Zellen konnten mit zwei wichtigen phenolischen Vertretern, isoliert aus grünen Tee-Extrakten [Catechin und Epigallocatechin-gallat (EGCG)], stimuliert werden. Dabei zeigten sich einige stimulierende und konzentrationsabhängige Effekte auf die gesamten RNA Expression und auf die mRNA Expressionslevel von ausgewählten Markergenen. In unseren Studien bewirkten höhere EGCG- und Catechin- Konzentrationen eine Verringerung der gesamten RNA Expression, wobei EGCG den größeren Effekt zeigte. Bei dem zweiten in vitro Versuchsansatz konnte festgestellt werden, dass EGCG und Catechin meist die beobachteten mRNA Expressionen von pro-inflammatorischen Markergenen abregulierte. Catechin verursachte eine Aufregulierung des pro-inflammatorischen Zytokins TNFa. EGCG erhöhte TNFa mRNA Expression nur in sehr hohen Konzentrationen. Zusammenfassend kann man in den zwei in vitro Zellkulturversuche von positiven Effekten bei beiden Flavanoide sowohl auf die immunrelevanten Zytokine als auch auf die Expression der Transkriptionsfaktoren feststellen. Höhere Flavanoidgaben zeigten ausgeprägtere Einflüsse als geringere, wobei EGCG die mRNA Genexpression stärker veränderte als Catechin. Der Schwerpunkt des Forschungsvorhabens bildete der in vivo Fütterungsversuch in Zusammenarbeit mit dem Institut für Tierernährung und Futterwirtschaft (LfL) in Grub. Im Fütterungsversuch wurden 78 Ferkel mit 3,5% TS Apfel- oder Rotweintrester gefüttert. Als Beobachtungszeitraum wurden die Tage um den Absetztermin gewählt, da dort die meisten immunrelevanten Veränderungen in der Umwelt und beim Futterwechsel stattfinden, und auch bekanntermaßen die meisten Ferkelverluste zu verzeichnen sind. In Zusammenarbeit mit der Fachgebiet für Obstbau, TUM Weihenstephan konnten die wichtigsten Polyphenolvertreter im Futter, im Mageninhalten und im Chymus nachgewiesen werden. In den tierischen Organen und Geweben waren mittels sensitiver HPLC Analytik nur Spuren der Polyphenole nachweisbar. Es konnten keine Unterschiede in den täglichen Zunahmen der einzelnen Fütterungsgruppen beobachtet werden. Die beiden polyphenolreichen Fütterungen zeigten einen positiven Einfluss auf die Bakterienpopulationen im Colon. In den Trester behandelten Gruppen wurden krankmachende E. coli Bakterienstämme mehr verdrängt, während sich die Anzahl der gesundheitsfördernden Laktobazillen erhöhte. Auch im Blutbild konnten unterschiedliche Effekte durch die Fütterungen gemessen werden. Die Ergebnisse des Blutbildes zeigten, dass die Leukozytenzahl in der Kontrollgruppe anstieg, was auf eine Aktivierung des Immunsystems hinweist, wobei sich in den Behandlungsgruppen keine Veränderung zeigte. Die Thrombozytenzahl ging bei der Rotweintrestergruppe signifikant zurück. Die darmmorphometrischen Studien via Histologie ergaben, dass die unterschiedlichsten Effekte der polyphenolreichen Fütterungen im Jejunum, Ileum und im Colon nachweisbar waren. Die Lymphfollikelflächen der Peyerschen Platten im Ileum nahmen nur in der Kontrollgruppe zu, was, wie im Blut, für eine Aktivierung des Lymphsystems in der nicht behandelten Kontrollgruppe spricht. In den Expressionsanalysen wurde gezeigt, das Caspase 3 im Jejunum mit der Zeit abreguliert wurde, dagegen im Colon aufreguliert. Die Veränderungen waren in den Behandlungsgruppen oft signifikant größer als in der Kontrollgruppe. Die in vivo Studie zeigte, dass sich die beide Tresterfütterungen bei den Ferkeln gesundheitsfördernd auswirkten. Sowohl die Darmflora, Lymphknoten (Peyersche Platten im Ileum) sowie die Darmzotten wurden von beiden Tresterfütterungen positiv beeinflusst. Um die Leistungsfähigkeit der beiden hier getesteten polyphenolreichen Zusatzstoffe abschließend bewerten zu können, sind weitere Feldversuche mit definierten Immunstimuli notwendig. Bei der praktischen Umsetzung könnten Obst- und Weinbauern für den neuen Absatzmarkt ihrer Restprodukte sensibilisiert werden. Getrockneter Apfeltrester wird auch für andere Spezies bereits als Futtermittel vertrieben. Weintrester wird bis jetzt kaum über den Handel als Futtermittel für Schweine vermarktet. Weiterhin wurden Studien mit verschiedenen Laktulosedosierungen sowie vergleichend mit Fructo-Oligo-Sacchariden und Laktulose jeweils bei Mastkälbern durchgeführt, die zur Zeit ausgewertet werden.

III. Reproduktionsbiologie

1) Ovar

Angiogenese und Ovarfunktion
Angiogenesis and ovarian function
Berisha, B.: ANASH Approaching Science 1 (2006) 9-13

Veränderungen in der Expression von FGF2 und seiner Rezeptoren in Rinderfollikeln vor und nach GnRH Applikation sowie nach der Ovulation
Changes in fibroblast growth factor 2 and its receptors in bovine follicles before and after GnRH application and after ovulation
Berisha, B.; Steffl, M.; Amselgruber, W.; Schams, D.:
Reproduction 131 (2006) 319-329

Expression von FGF1 und FGF7 in dominanten Follikeln nach GnRH Applikation beim Rind
Expression of fibroblast growth factor 1 (FGF1) and FGF7 in mature follicles during the periovulatory period after GnRH in the cow
Berisha, B.; Welter, H.; Shimizu, T.; Miyamoto, A.; Meyer, H.H.D.; Schams, D.:
Journal of Reproduction and Development 52 (2006) 307-313
Ziel der vorliegenden Arbeiten war es, die mRNA Expression, Proteinkonzentration sowie deren Lokalisation (Immunhistochemie) von angiogenen Faktoren im Follikel und Gelbkörper des Rindes während verschiedener funktioneller Phasen zu untersuchen. Unsere früheren Untersuchungen haben gezeigt, dass Mitglieder der FGF Familie an der Angiogenese, insbesondere im dominanten Follikel, beteiligt sind, sowie die Funktion und Proliferation der Granulosazellen modulieren können. Ziel der aktuellen Arbeiten war die Auswertung von zeitlich definierten Follikelproben, die vor und nach dem LH Gipfel und nach der Ovulation gewonnen wurden. Um genügend Gewebematerial für die Studien an Follikeln zur mRNA Expression, Proteinkonzentration und Proteinlokalisation zu erhalten, wurden Superovulationen herbeigeführt: Nach Induzierung der Luteolyse mit einem PGF2a-Analogon, Stimulation des Follikelwachstums mit FSH und Injektion von GnRH zur Induktion der Ovulation wurden Follikel bzw. frische CL durch transvaginale Ovarektomie gewonnen (n=5/Gruppe). Die Follikel wurden in folgende Gruppen eingeteilt: (I) Vor GnRH Injektion; (II) 4h nach GnRH (während des LH Gipfels); (III) 10h; (IV) 20h; (V) 25h (während der Ovulation) und (VI) 60h nach GnRH (nach der Ovulation; CL Tag 2-3). Zur Charakterisierung der Follikelgruppen wurden die Konzentrationen von Östradiol, Progesteron, PGF2a und PGE2 in der Follikelflüssigkeit (FF) gemessen. Die Ergebnisse zeigten eine ausgeprägte mRNA Expression, Protein Konzentration und deutliche Lokalisations-Wechsel von FGF2 in Follikelgruppen während der periovulatorischen Phase (vor LH: Hauptsächlich in Endothelzellen und Pericyten von Blutgefässen; nach LH: Nur im Zellkern von Granulosazellen). Es konnte gezeigt werden, dass die mRNA Expression von FGF2 und FGF7 während des LH Peaks und nach der Ovulation am stärksten war, die von FGF1 dagegen nur nach der Ovulation (im CL). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Faktoren beim Follikelendwachstum, der Follikelzelldifferenzierung sowie Gelbkörperanbildung eine wichtige Rolle spielen.

Effekt intralutealer Injektionen von Endothelin Rezeptor A-Antagonisten nach einer PGF2a-induzierten Luteolyse im Rind
Effect of intraluteal injection of endothelin type A receptor antagonist on PGF2a-induced luteolysis in the cow
Watanabe, S.; Shirasuna, K.; Matsui, M.; Yamamoto, D.; Berisha, B.; Schams, D.; Miyamoto A.:
The Journal of Reproduction and Development 52 (2006) 551-559
Experimente deuten darauf hin, dass Endothelin-1 (ET-1) über seinen ET-A Rezeptor (ETR-A) eine Schlüsselrolle für die Gelbkörper Regression spielt. Ziel dieser Arbeit war es, die Effekte von ETR-A Antagonisten während induzierter Luteolyse beim Rind zu untersuchen. Dazu erhielten Corpora lutea (CL) von Kühen am Zyklustag 10-12 intraluteale Injektionen von ETR-A Antagonist (5 Injektionen zu den Zeitpunkten 0.5, 2, 4, 6, und 8 h nach induzierter Luteolyse). Die Progesteronkonzentration im Blutplasma sowie die mRNA Expression von steroidogenen Regulatoren (3b-HSD) nach der induzierten Luteolyse wurden nicht beeinflusst. Jedoch verzögerte sich die Volumenabnahme des CL um fast zwei Tage in der Behandlungsgruppe. Die mRNA Expression von preproET-1 und ETR-B stieg in der Behandlungs- und Kontrollgruppe an. Im Gegenteil dazu wurde die ETR-A mRNA Expression nicht beeinflusst. Die vorliegende Untersuchung deutet darauf hin, dass ET-1 über ETR-A die strukturelle Luteolyse reguliert, indem es die Blutgefässkontraktion im CL während der Luteolyse steuert.

2) Ovidukt

Morphologische und funktionelle Charakterisierung einer Suspensionszellkultur von Eileiterepithelzellen des Rindes, die für die Studie von embryo-maternalen Interaktionen besonders geeignet ist
A bovine oviduct epithelial cell suspension culture system suitable for studying embryo-maternal interactions: morphological and functional characterization
Rottmayer, R.; Ulbrich, S.E.; Kölle, S.; Prelle, K.; Neumueller, C.; Sinowatz, F.; Meyer, H.H.D.; Wolf, E.; Hiendleder, S.: Reproduction 132 (2006) 637-648
Der Rindereileiter ist durch die Bereitstellung eines optimalen Milieus für eine erfolgreiche Befruchtung und für den Verbleib der Gameten und des frühen Embryos verantwortlich. Die Suspensionskultur von Epithelzellen des Rindereileiters wurde optimiert und systematisch mittels morphologischer (Immunohistochemie, Elektronenmikroskopie) und molekularbiologischer (qRT-PCR, Western Blot) Methoden charakterisiert. Dieses physiologische in vitro-Modell eignet sich nun hervorragend für exogene Stimulationen und die Kokultur mit Eizellen und Embryonen.
 

Regionenspezifische Expression von Stickoxidsynthasen im Rindereileiter während des östrischen Zyklus und in vitro
Region-specific expression of nitric oxide synthases in the bovine oviduct during the oestrous cycle and in vitro
Ulbrich, S.E.; Rehfeld, S.; Bauersachs, S.; Wolf, E.; Rottmayer, R.; Hiendleder, S.; Vermehren, M.; Sinowatz, F.; Meyer, H.H.D.; Einspanier, R.:
Journal of Endocrinology 188 (2006) 205-213
Untersucht wurde eingehend die Bedeutung von zwei Enzymen der Stickstoffmonoxid-Synthese. Mittels Gen- und Proteinexpressionsmessungen und der Proteinlokalisation wurden deutliche zyklische Änderungen festgestellt und in vivo übereinstimmende Expressionsmuster gefunden. Funktionelle Implikationen können mit lokalen Kontraktionen in Verbindung gebracht werden oder mit einer Beteiligung des Eileiterepithels an der Regulierung der Immunantwort gegenüber den Gameten. Zusammengenommen unterstreichen die Befunde die physiologische Bedeutung des Eileitermilieus für die Unterstützung einer erfolgreichen Reproduktion.

Morsezeichen im Uterus
Ulbrich, S.E.:
TUM Mitteilungen Heft 3 (2006) 64-65
Eingriffe in die veterinärmedizinische und humane Fortpflanzung erlangen zunehmend größere Bedeutung. Dagegen sind die naturwissenschaftlichen Mechanismen der komplexen Abläufe, die in die Entstehung eines neuen Lebens münden, in vielen Bereichen noch ungeklärt. Die Befunde der am Lehrstuhl für Physiologie angefertigten Dissertation unterstreichen die physiologische Bedeutung des Eileiters für die Unterstützung der Entwicklung des Embryos und damit der erfolgreichen Reproduktion.

3) Endometrium

Embryo-induzierte transkriptomische Veränderungen im Rinderendometrium lassen spezies-spezifische und allgemeine Marker für die uterine Rezeptivität erkennen
Embryo-induced transcriptome changes in bovine endometrium reveal species-specific and common molecular markers of uterine receptivity
Bauersachs, S.; Ulbrich, S.E.; Gross, K.; Schmidt, S.E.M.; Meyer, H.H.D.; Wenigerkind, H.; Vermehren, M.; Sinowatz, F.; Blum, H.; Wolf, E.:
Reproduction 132 (2006) 319-331

Ein monozygotisches Zwillingsmodell deckt neue embryo-induzierte Transkriptom-veränderungen im Endometrium des Rindes während der Präimplantationsperiode auf
Monozygotic twin model reveals novel embryo-induced transcriptome changes of bovine endometrium in the pre-attachment period
Klein, C.; Bauersachs, S.; Ulbrich, S.E.; Einspanier, R.; Meyer, H.H.D.; Schmidt; S.E.M.; Reichenbach, H.D.; Vermehren, M.; Sinowatz, F.; Blum, H.; Wolf, E8:
Biology of Reproduction 74 (2006)  253-264
Während der frühen Gravidität moduliert der Embryo eine ganze Reihe von Genen in der Gebärmutterschleimhaut (Endometrium) des Rindes, die für eine exakt abgestimmte embryo-maternale Kommunikation wesentlich von Bedeutung sind. In zwei holistischen Transkriptom-Untersuchungen, die das trächtige mit dem nicht trächtigen Endometrium verglichen, konnten jeweils mehr als 40 Interferon-abhängige Gene identifiziert werden. Eine Reihe weiterer neuer Gene, die an der  Regulation der Transkription, Zelladhäsion, am Umbau des Endometriums sowie an der Modulation des maternalen Immunsystems beteiligt sind, wurden ebenfalls differenziell exprimiert. Die Untersuchungen unterstreichen die signalgebende Bedeutung des Embryos für die Vorbereitung des Endometriums auf die Implantation beim Rind.

4) Placenta

Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) 1, FGF2, FGF7 und FGF Rezeptoren werden in Trophoblastriesenzellen während der eingeschränkten Trophoblastinvasion des Rindes parallel exprimiert
Fibroblast growth factor (FGF) 1, FGF2, FGF7 and FGF receptors are uniformly expressed in throphoblast giant cells durinig restricted trophoblast invasion in cows
Pfarrer, C.; Weise, S.; Berisha, B.; Schams, D.; Leiser, R.; Hoffmann, B.; Schuler, G.:
Placenta 27 (2006) 758-770
Die bovine Plazenta zeichnet sich durch eine eingeschränkte Invasion von Trophoblastriesenzellen (TGC) aus. Im Gegensatz zu mononukleären Trophoblastzellen (MTC) sind TGC nicht polarisierte Zellen, die auf das uterine Epithel zu migrieren und dort mit einzelnen Epithelzellen fusionieren. Fibroblastenwachstumsfaktoren (FGF) wurden mit einer migratorischen Aktivität, Zelldifferenzierung und Angiogenese in Zusammenhang gebracht, und aufgrund ihrer Lokalisation in Trophoblastzellen als wichtige Regulatoren in der hämochorialen Plazenta von Nagern und Menschen sowie der (syn)epitheliochorialen Plazenta von Schwein und Schaf postuliert. Da migrierende bovine TGC epithelialen Ursprungs sind, aber auch Ähnlichkeiten mit mesenchymalen Zellen aufweisen, wird vermutet, dass die eingeschränkte Trophoblastinvasion des Rindes von einem spezifischen FGF Expressionsmuster begleitet wird. Daher wurde die zeitliche und räumliche Expression spezifischer FGF Faktoren untersucht: Rezeptor Paare, die entweder auf Zellen mesenchymaler Herkunft oder auf Epithelzellen in der bovinen Plazenta während der Trächtigkeit und präpartum mittels Immunhistochemie, semiquantitativer RT-PCR und in situ Hybridisierung. Neben einem spezifischen zellulären Expressionsmuster wurde eine deutliche Verschiebung der mRNA von FGF1, -2, -7, gesamt FGFR und den FGFR2 Isoformen IIIb und IIIc von den unreifen TGC in das maternale Stroma, insbesondere Endothelien, beobachtet. Die spezifische Kolokalisation aller untersuchten Mitglieder der FGF Familie in TGC lässt vermuten, dass TGC neben ihrer klassischen Funktion als Hormonproduzent eine wichtige Rolle für die Regulation des bovinen Plazentomwachstums, der Differenzierung und der Angiogenese spielen.

Lokalisation von vascular endothelial growth factor (VEGF) und seinen Rezeptoren VEGFR-1 und VEGFR-2 in bovinen Plazentomen von der Implantation bis zur Geburt
Localization of vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors VEGFR-1 and VEGFR-2 in bovine placentomes from implantation until term
Pfarrer, C.D.; Ruziwa, S.D.; Winther, H.; Callesen, H.; Leiser, R.; Schams, D.; Dantzer, V.:
Placenta 27 (2006) 889-898
Angiogenese fördernde Interaktionen von vascular endothelial growth factor (VEGF) mit seinen Rezeptoren VEGFR-1 and VEGFR-2 wurden für die Plazentation von Mensch, Nerz und Schwein beschrieben. Die bovine Plazenta wird aufgrund der Anwesenheit von wandernden Trophoblastriesenzellen (TGC) als synepitheliochorial bezeichnet. Um die Rolle von VEGF für die bovine Implantation und Plazentation zu erforschen, wurden Plazentome und interplazentomäres Gewebe von 33 Kühen (von der frühen Implantation bis zur Geburt) mittels Immunhistochemie lokalisiert. Die Anwesenheit von VEGF, VEGFR-1 und VEGFR-2 an der fetomaternalen Kontaktfläche und im Gefäßsystem lässt darauf schließen, dass VEGF in der Rinderplazenta folgende Funktionen haben könnte 1) klassische Stimulation von Angiogenese und Gefäßpermeabilität 2) Wachstumsfaktoraktivität, die den fetomaternalen Austausch über parakrine Wege beeinflusst 3) chemotaktische Anlockung von Kapillarendothelien und 4) die autokrine Regulation der Migration der TGC.

IV. ABC Transporter: Bedeutung in Human- und Tierphysiologie

 Identifizierung des bovinen Cholesterinefflux-Regulatorproteins ABCA1 – funktionelle Bedeutung in verschiedenen Geweben
Identification of the bovine cholesterol efflux regulatory protein ABCA1 - functional importance in various tissues
Farke, C.; Viturro, E.; Meyer, H.H.D.; Albrecht, C.:
Journal of Animal Science 84 (2006) 2887-2894
Von dem “ATP-binding cassette transporter A1” (ABCA1) weiß man, dass er eine signifikante Rolle beim zellulären Export von Phospholipiden und Cholesterin im Menschen spielt. ABCA1 könnte auch eine entscheidende Rolle in der zellulären Cholesterinhomöostase in der Kuh spielen, aber sowohl seine Präsenz als auch die Verbreitung in Geweben ist bisher unbekannt. Deswegen haben wir die Expression des bovinen ABCA1-Transporters mittels quantitativer PCR studiert und den gesamten ABCA1-kodierenden Bereich sequenziert. Zusätzlich wurde auch der proximale Promotor identifiziert und nach regulativen Elementen gesucht. Expression boviner ABCA1 mRNA wurde in allen getesteten Geweben gefunden, was mit den Daten aus anderen Säugetierspezies übereinstimmt. Die höchsten Expressionsniveaus wurden in Lunge, Ösophagus, Uterus, Milz und Muskel nachgewiesen.

Eine Sequenzanalyse zeigte, dass der offene Leserahmen dieses Gens aus 6786 Basen besteht und für ein Protein aus 2261 Aminosäuren mit einem prognostizierten Gewicht von 254 kDa kodiert. Das abgeleitete bovine ABCA1 Protein weist eine hohe Homologie mit der Aminosäuresequenz aus Mensch (94%), Maus (93%), Ratte (92%) und Huhn (85%) auf. Eine Analyse der mutmaßlichen Promotorregion zeigte potentielle Bindestellen für Transkriptionsfaktoren, die mit ABCA1 Transkription und Lipidstoffwechsel in Verbindung gebracht werden. Diese Studie könnte neue Wege zur Aufklärung der Rolle von ABCA1 in der Sterolhomöostase im bovinen Organismus öffnen.

Identifizierung, Sequenzanalyse und mRNA Gewebeverteilung der bovinen Steroltransporter ABCG5 und ABCG8
Identification, sequence analysis and mRNA tissue distribution of the bovine sterol transporters ABCG5 and ABCG8
Viturro, E.; Farke, C.; Meyer, H.H.D.; Albrecht, C.: Journal of Dairy Science 89 (2006) 553-561
Die Familie der “ATP-binding cassette“ (ABC) Transporter besteht aus verschiedenen Transmembranproteinen, welche ATP-Hydrolyse als Engergiequelle für den Transport von unterschiedlichen Substanzen über die Zellmembran nutzen.

Zwei Mitglieder dieser Familie, ABCG5 und ABCG8, sind an der intestinale Absorption und Exkretion (über die Galle) von Sterolen beteiligt. Der Cholesteringehalt in der Milch variiert sehr stark zwischen Arten, Rassen und Individuen einer Art, aber eine mögliche Beteiligung dieser beiden Gene in der Lipidhomöostase in der Milchdrüse wurde nie besprochen.
In dieser Studie wurde die Expression von ABCG5 und ABCG8 im Rind zum ersten Mal demonstriert und mittels quantitativer PCR charakterisiert. Die vollständige kodierende Region und der Promotor wurden sequenziert und nach Motiven, die in die Lipidhomöostase verwickelt sind, überprüft. Sowohl ABCG5 als auch ABCG8 wiesen einen hohen Grad an Längen- und Sequenzhomologie im Vergleich mit anderen Säugetierspezies auf. In der Promotorregion, die zwischen den beiden Transportergenen liegt, wurden zwei GATA-Boxen, ein „liver receptor homolog-1 response element“ und ein „nuclear factor-kappaB response element“ – wichtige Faktoren in anderen lipidregulierenden Prozessen – identifiziert.
Wie erwartet, wurden hohe Expressionsniveaus beider Transporter, ABCG5 und ABCG8, in der Leber, im Verdauungstrakt und interessanterweise in der Milchdrüse gefunden, was neue Möglichkeiten für die weitere Erforschung ihrer Rolle beim Lipidtransport und der Ausscheidung während der Laktation eröffnet.

V. Bioanalytik

Einfluss der RNA Integrität auf die Qualität der quantitativen real-time RT-PCRRNA integritiy and the effect on the real-time qRT-PCR performanceFleige, S.; Pfaffl, M.W.: Molecular Aspects of Medicine 27 (2006) 126-139Comparison of relative mRNA quantification models and the impact of RNA integrity in quantitative real-time RT-PCRFleige, S.; Walf, V.; Huch, S.; Prgomet, C.; Sehm, J.; Pfaffl, M.W.: Biotechnology Letters 28 (2006) 1601-1613Die Anwendung der Reversen Transkription (RT) mit nachfolgender Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zum Nachweis einer spezifischen mRNA ist heute ein Routinewerkzeug in vielen molekularbiologischen Laboren. Vorraussetzung für einen zuverlässigen quantitativen mRNA Nachweis ist eine optimale RNA Extraktion, eine Qualitätskontrolle der extrahierten RNA, eine etablierte RT-PCR Methode zur quantitativen Bestimmung der mRNA Mengen, und die Wahl einer sinnvollen Quantifizierungstrategie, sowie die statistische Auswertung der Ergebnisse.Bevor die quantitative mRNA Analyse der Kandidatengene durchgeführt werden kann, sind einige Schwellen zu überwinden. Gerade in den Arbeitsschritten der Prä-Analytik verstecken sich die meisten Fehlerquellen und führen zu ungenauen Expressionsergebnissen sowie zu großen Variabilitäten der Ergebnisse. Die Probennahme stellt in der veterinärmedizinischen und agrarwissenschaftlichen Forschung fast immer ein Problem dar. Oft werden Proben von lebenden Tieren mittels Biopsie entnommen oder die Gewebeproben stammen von inhomogenen Tieren vom Schlachthof. Auch ist die schnelle Lagerung in flüssigem Stickstoff (N2) oder RNA stabilisierenden Agenzien (RNA Later, Ambion), nicht immer optimal gewährleistet. Die RNA Lagerung sowie die Extraktionen aus Formalin fixierten Geweben oder mittels Laserstrahl (Laser Mikrodissektion) präparierte Zellen haben einen gewaltigen Einfluss auf die RNA Quantität, RNA Qualität sowie auf die folgende quantitative Analytik. Im Weitern ergeben sich in der Praxis große Schwankungen in der RNA Quantität und Integrität bei der Anwendung unterschiedlicher RNA Extraktionsmethoden. Meistens finden flüssig-flüssig Extraktionen oder auf Säulen basierende RNA Extraktionssysteme Anwendung, die sich aber in Effizienz und Qualität der RNA von Labor zu Labor unterscheiden. Um die Qualität sowie die Quantität der extrahierten RNA zu testen, empfiehlt sich die RNA Integrität mittels Kapillarelektrophorese zu überprüfen.Der Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies) und der Experion (Bio-Rad) bieten hervorragende Möglichkeiten die total RNA in kleinsten Mengen (im pg Bereich) zu messen. Der Bioanalyzer 2100 ordnet der RNA Qualität einen Zahlenwert zu, die RNA Integrity Number (RIN). Auf Basis der ribosomalen Untereinheiten 18S und 28S rRNA und deren Verhältnis wird von der Software ein RIN Wert ermittelt, in der Skala von 1, entspricht schlechter RNA Qualität (=> stark degradierte RNA) bis 10, was einer sehr gute RNA Qualität entspricht (=> intakte RNA). Die Studien ergaben, dass RIN Werte größer als 8 als optimal gelten und zwischen 5 und 8 als gut einzustufen sind, ohne große Beeinträchtigung in der relativen Quantifizierung.

Verteilungsabhängige Cluster-Analyse mit SAS für real-time PCR Genexpressionsanalysedaten für stabil exprimierte Gene
Distribution-intensive cluster analysis in SAS on real-time PCR gene expression data of steadily expressed genes
Tichopád, A.; Pecen, L.; Pfaffl, M.W.:
Computer Methods and Programs in Biomedicine 82 (2006) 44-50

Neue Entwicklungen in der post-qPCR-Datenanalyse
Pfaffl, M.W.:
Laborwelt 7 (2006) 10-13

Vorraussetzung für einen zuverlässigen quantitativen Nachweis ist eine funktionierende Analytik und Datenauswertung, die exakte Quantifizierungsergebnisse bei ausreichender Genauigkeit und hoher Wiederholbarkeit liefern. Bei der relativen Quantifizierung wird die Genexpression eines Zielgenes auf ein oder mehrere Referenz-Gen(e) (= Referenzgen Index) bezogen. Man nennt diesen Vorgang auch Normalisierung der Expressionsergebnisse. Die relative Quantifizierung lässt sich weiter optimieren, indem man die unterschiedlichen qPCR Effizienzen der untersuchten Gene mit einbezieht. Die effizienz-korrigierte relative Quantifizierung mittels real-time qRT-PCR stellt bis dato die eleganteste Form der Nukleinsäure Quantifizierung dar (REST).

In den letzten Jahren haben sich die Biotech Unternehmen sowie die universitäre Forschung in erster Linie der Entwicklung neuer Farbstoffe, Hardware und Detektionssystemen gewidmet. Die post-qPCR Datenanalyse der gewonnenen Ergebnisse ist eher in den Hintergrund gedrängt worden. Auf der Basis neu entwickelter qPCR Applikationen und der stark wachsenden Zahl generierter qPCR Datensätze wird ein Umdenken in der post qPCR Datenanalyse gefordert. Die qPCR Datenanalyse muss transparenter und reproduzierbarer gemacht werden! Einige ausgeklügelte Algorithmen sind schon entwickelt und in existierende Software Applikationen implementiert worden, aber es fehlt noch an zuverlässigen post qPCR Applikationen, die leicht verständliche Ergebnisse liefern. In Zukunft wird das Augenmerk wohl mehr auf der post qPCR Datenanalyse, der qPCR Bioinformatik, liegen. Mit der Entwicklung der Quantifizierungssoftware REST in 2002, die inzwischen zu einem Standardtool in der relativen Quantifizierung geworden ist, und mit der SAS basierten Cluster Analyse haben wir diesem Problem Rechnung getragen und erhoffen uns eine transparentere und einfach anzuwendende relative Quantifizierung.

 

© Lehrstuhl für Tierphysiologie und Immunologie    

    Letzte Änderung: 29.10.2015