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Forschungsaktivitäten 2005:

I.   Laktationsphysiologie

II.  Lebensmittelsicherheit, Ernährung und Umwelt

II.  Reproduktionsbiologie

VI. ABC Transporter: Bedeutung in Human- und Tierphysiologie

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I. Laktationsphysiologie

Die Verteilung der Leukozytenpopulationen und die Milchzusammensetzung in Gemelksfraktionen von gesunden Eutervierteln bei Milchkühen
Distribution of leucocyte populations, and milk composition, in milk fractions of healthy quarters in dairy cows
Sarikaya, H.; Werner-Misof, C.; Atzkern, M.; Bruckmaier, R.M.:
Journal of Dairy Research 72 (2005) S. 486-492
Um die Rolle der Leukozytenpopulationen bei der Immunantwort in den unterschiedlichen Geweben des Euters zu untersuchen, wurden verschiedene Gemelksfraktionen, d. h. die Zisternenmilch, die Alveolarmilch (unterteilt in vier Fraktionen) und die Residualmilch auf die Hauptbestandteile, die somatische Zellzahl und die Verteilung der Leukozytenpopulationen sowie deren Lebensfähigkeit untersucht. Der Fettgehalt der Milch stieg im Verlauf des Melkens kontinuierlich an und erreichte sein Maximum in der Residualmilch. Protein- und Laktosegehalt stiegen bis zum ersten Viertel der Alveolarmilch an, sanken dann aber wieder ab. Die Elektrolyte sank zuerst bis zum ersten Viertel der Alveolarmilch, stieg dann aber bis zur Residualmilch wieder an. Die Elektrische Leitfähigkeit sank von der Zisternenmilch zur ersten Alveolarmilch ab und verblieb im weiteren Verlauf der Melkung auf diesem Niveau. Der somatische Zellgehalt sank bis zum ersten Viertel der Alveolarmilch ab, um dann kontinuierlich bis zu seinem Maximum in der Residualmilch anzusteigen. Die Lebensfähigkeit der somatischen Zellen stieg fortlaufend an und war maximal in der Residualmilch. Das Verhältnis der Zellpopulationen wies einen umgekehrten Trend der Makrophagen und der polymorphkernigen Neutrophilen (PMN) auf. Während Makrophagen in der Zisternenmilch die Hauptfraktion darstellten, fanden sich PMN zum größten Teil in der Residualmilch. In allen Gemelksfraktionen war der Lymphozytenanteil ähnlich und im Bereich von 10 % der Zellen; lediglich in der letzten Alveolarmilchfraktion war er erhöht. Innerhalb der Zellfraktionen Lymphozyten, PMN und Makrophagen zeigte sich im Verlauf des Melkens ein ähnliches Bild: hohe Gehalte in der Zisternenmilch sanken zu einem Minimum im ersten Viertel der Alveolarmilch und stiegen kontinuierlich zu einem Maximum in der Residualmilch an. Die Ergebnisse zeigen, dass in gesunden Eutervierteln Makrophagen der vorherrschende Zelltyp in der Zisternenmilch lokalisiert sind, d.h. nahe dem Strichkanal, der Eintrittspforte für Erreger. Offensichtlich stellen sie die erste immunologische Barriere für Erreger dar. Im Gegensatz dazu sind PMN der wichtigste Zelltyp in der Alveolarmilch. Dennoch hat jede Leukozytenpopulation einen höheren Anteil in der Zisternenmilch als in der frühen Alveolarmilch, was für die bedeutende Rolle der Immunantwort in der Zisternenmilch spricht.

Physiologische- und Verhaltensauswirkungen des Wechsels vom konventionellen zum automatischen Melksytem bei Milchkühen mit und ohne vorheriger Erfahrung
Physiological and behavioural effects of changeover from conventional to automatic milking in dairy cows with and without previous experience
Weiss, D.; Moestl, E.: Bruckmaier, R.M.:
Vet. Med.- Czech 50 (2005)  253-261
Der Wechsel von einem konventionellen Melkstand zu einem automatischen Melksystem (AMS) zeigte unterschiedliche Auswirkungen auf physiologische Parameter bei erfahrenen Kühen im Vergleich zu unerfahrenen. Der Anstieg der Herzfrequenz beim ersten Besuch des AMS war bei unerfahrenen Tieren deutlich höher als bei erfahrenen. Die erfahrenen Kühe besuchten das AMS freiwillig ohne Eingreifen des Personals. Der Anteil der freiwilligen Besuche stieg bei den unerfahrenen Tieren innerhalb der ersten 10 Tage deutlich an. Cortisol-Metaboliten im Kot blieben durch den Wechsel zum AMS unbeeinflusst. Bei den unerfahrenen Kühen war die Milchejektion während der ersten Melkungen gestört und somit die mittlere Milchmenge im Vergleich zum konventionellen Melksystem erniedrigt, während bei den erfahrenen Kühen die Milchejektion ungestört verlief und die mittlere Milchmenge sogar über der Milchmenge im konventionellen Melksystem lag. Erfahrene Kühe brauchen deshalb auch nach einer kurzen Phase im konventionellen Melkstand keine erneute Angewöhnung an das AMS, wohingegen unerfahrene Kühe eine intensive Angewöhnung benötigen um Milchproduktionsverluste zu minimieren.

Optimierung der individuellen Vorstimulation bei Milchkühen
Optimization of individual prestimulation in dairy cows
Weiss, D.; Bruckmaier, R.M.:
Journal of Dairy Science 88 (2005)137-147
Die Anwendung einer Vorstimulation verändert den Verlauf der Milchabgabe im Vergleich zur Melkung ohne Vorstimulation. Der Einfluss einer Vibrationsvorstimulation von 0 bis 90s sowie verschiedener maximaler Pulsationsvakuums-Einstellungen während der Vibrationsstimulation auf die Ocytocinfreisetzung und auf Melkbarkeitsparameter wurden untersucht. Mit steigendem maximalen Pulsationsvakuum während der Vibrationsstimulation stieg der Milchfluss während der Vorstimulation an, wirkte sich aber nicht negativ auf die Melkbarkeitsparameter aus. Der Zusammenhang, dass die Verzögerungszeit vom Beginn der Zitzenstimulation bis zum Beginn der Milchejektion mit dem Grad der Euterfüllung, der als prozentualer Anteil der geschätzten Speicherkapazität festgesetzt wurde, negativ korreliert ist, ist der Grund für die unterschiedliche optimale Dauer der Vorstimulation. Um unverzüglichen stetigen Milchfluss zum Melkbeginn zu erreichen, betrug die optimale Dauer der Vorstimulation bei Eutern mit geringen Milchmengen 90s, während sie bei gut gefüllten Eutern nur 20s betrug. Eine kurze Vorstimulation erhöht den Stalldurchsatz bei vollen Eutern und eine verlängerte Vorstimulation vermindert die Vakuumbelastung auf die Zitze bei der Melkung von nicht vollen Eutern.

II. Lebensmittelsicherheit, Ernährung und Umwelt

Fütterungsstudien mit gentechnisch verändertem Mais: Untersuchungen zum Abbau von transgener DNA und Novel-Protein im Magen-Darm-Trakt des Rindes – Einfluss auf Produktsicherheit und Qualität von Fleisch und Milch
Degradation of Cry1Ab protein from genetically modified maize in the bovine gastrointestinal tracts
Lutz, B.; Wiedemann, S.; Einspanier, R.; Meyer, J.; Albrecht, C.:
Journal of Agricultural and Food Chemistry 53 (2005) S. 1453-1456

Produktsicherheit bei Fleisch und Milch
Wiedemann, S.; Albrecht, C.; Meyer, H.H.D.:
MAIS 32 (2005) S. 46-49

Transgene Futtermittel – Einfluss auf die Milchqualität?
Lutz, B.; Albrecht, C.; Meyer, H.H.D.:
dmz (Deutsche Molkerei Zeitung) 126 (2005) S. 30-33
In den vergangenen Jahren wurde in der Öffentlichkeit vermehrt über Futter- und Lebensmittel aus gentechnisch veränderten Organismen (GVO) diskutiert. Insbesondere Befürchtungen, dass GVO-Bestandteile nach der Aufnahme durch Rinder über die Verdauung in Fleisch und Milch gelangen könnten, trugen zu einer Verunsicherung der Verbraucher bei. Die unerwartete Nachweisbarkeit des Cry1Ab Proteins, der gegen Maiszünslerlarven wirksamen Komponente des GV Maises Bt-176, im Gastrointestinaltrakt des Rindes, veranlasste uns, unterschiedliche Proteinnachweisverfahren zur Detektion von Cry1Ab Protein zu vergleichen. So testeten wir Proben aus zwei unabhängigen Fütterungsstudien mittels Immunoblot-Technik und verglichen diese Ergebnisse mit Resultaten der ELISA Methode, die auf einem kommerziellen Kitsystem basieren. Während die mit ELISA gewonnenen Ergebnisse auf eine ansteigende Konzentration von Cry1Ab im Gastrointestinaltrakt hinwiesen, ergaben die Resultate des Immunoblot-Verfahrens eine klare Degradation des Proteins im Magen-Darm-Traktes des Rindes. Es wurde nachgewiesen, dass die im ELISA erhaltenen positiven Signale auf Cry1Ab Proteinfragmente von etwa 17 und 34 kD zurückgehen. Diese offensichtliche Diskrepanz zwischen den beiden Proteinnachweisverfahren wurde anhand zweier unabhängiger Probensätzen verifiziert und lassen den Schluss zu, dass der im ELISA verwendete Antikörper mit Epitop-tragenden Fragmenten des Cry1Ab-Proteins reagiert. Um Missinterpretation der mittels ELISA gewonnenen Daten zu vermeiden, sollten Proben, die mit dieser Technik positiv getestet wurden, anhand einer weiteren Proteinnachweismethode wie z.B. Immunoblotting verifiziert werden. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass Cry1Ab Protein während der Verdauung im Magen-Darm-Trakt des Rindes abgebaut wird. Wissenschaftlich durchgeführte Fütterungsstudien mit GV Mais ergaben bisher keinen Nachweis von transgener DNA oder Novel-Protein in Fleisch oder Milch von Rindern.

Einfluss einer Laktoferrin-reichen Kälbermilchfütterung auf die Morphologie und die Expression von inflammatorischen Markern im gastro-intestinalen Trakt Prgomet, C.; Schwarz, F.; Pfaffl, M.W.: Abstractband „Milchkonferenz 2005“ der Deutschen Gesellschaft für Milchwissenschaft, 29.-30.09.2005, Kiel, S. 49
Short term effects on pro-inflammatory cytokine, lactoferrin, and CD14 mRNA expression levels in bovine immuno-separated milk and blood cells treated by LPS

Prgomet, C.; Sarikaya, H.; Bruckmaier, R.M.; Pfaffl, M.W.:
Journal of Veterinary Medicine A 52 (2005) S. 317-324
Polymorphkerniger neutrophile Granulozyten (PMN) wandern als Teil der Entzündungsreaktion gezielt aus der peripheren Blutbahn in die Milch. Die Mobilisierung von PMN erfolgt über zellvermittelte Immunität mittels Zytokine oder Chemokine, synthetisiert vom Eutergewebe und somatischen Milchzellen (SC). Da die Milch kein geeignetes Medium für phagozytierende PMN Zellen darstellt, ist die Immunantwort im Blutsystem bedeutend stärker als die in der Milchdrüse. Die Entzündungsreaktion steht in Zusammenhang mit der Konzentration von SC und den produzierten Zytokinen. Dessen Ausmaß und Geschwindigkeit haben einen gravierenden Einfluss auf den Verlauf und den Ausgang von Infektionen. Für ein besseres Verständnis der Wechselwirkung zwischen Zytokinsynthese und Regulationsmechanismen der Immunantwort während einer E. coli Mastitis, wurden Wirt-Phatogen Interaktionen in einem Zellkulturmodell studiert. In einem ersten Ansatz wurde deshalb die Transkriptionsaktivität von Laktoferrin (LF), des Zelloberflächenantigens 14 (CD14) und diversen Zytokinen in Lipopolysaccharide (LPS) aktivierten bovinen Leukozyten (WBC), Monozyten, SC und Milchmakrophagen verglichen.
Signifikante Zytokin mRNA-Zunahmen konnten in allen vier Zellkulturarten und Genen gemessen werden. In WBC und Monozyten konnte LPS eine höhere Genexpression mit längerer Persistenz auslösen als in entsprechenden Milchzellen. Dieser Unterschied kann der zentralen Rolle von LF und CD14 bei Entzündungsprozessen zugeschrieben oder durch die Blut-Milch Zellmigration begründet werden. In WBC and Monozyten wurde eine 6- bis 15-fach höhere konstitutive Transkription des CD14-Rezeptorgens als in adäquaten Milchzellen gemessen. Unabhängig von einer LPS-Behandlung war die mRNA Expression für LF in SC im Vergleich zu den anderen Zellkulturtypen über den gesamten Versuchszeitraum stark hochreguliert (14-fach bis 153-fach). Da die Milchzellen von Rindern mit subklinischer Mastitis isoliert wurden, unterstreichen diese Ergebnisse die schützende Rolle von LF im Euter während einer Infektion.
Eine gesunde Kälberaufzucht ist die Basis für eine erfolgreiche und wirtschaftliche Nutzung bei der Kälber- und Rindermast, aber auch für eine leistungsorientierte Milchviehhaltung. Bedingt durch das zukünftige Verbot von Antibiotika bedarf es einer Neuorientierung zur Gesundheitsprophylaxe und Leistungsstabilisierung in der Kälberfütterung. Lactoferrin (LF) als Futterzusatzstoff und natürlicher Milchinhaltsstoff stellt eine Alternative mit darmstabilisierender Wirkung dar. LF ist ein eisenbindendes bioaktives Glycoprotein, das in zahlreichen in vitro- und in vivo-Untersuchungen anti-mikrobielle, anti-virale, anti-mykotische und immunmodulierende Eigenschaften bewiesen hat.
Ziel der Arbeit war es die Effekte des LF hinsichtlich der Expression von inflammatorischen Markern in Blut und im gastro-intestinalen Trakt, sowie auf die Morphologie im Dünn- und Dickdarm zu untersuchen. Eine Gruppe von 20 Kälbern erhielt den mit 0,18% TS LF versetzten Milchaustauscher, die zweite Gruppe diente als Kontrolle (n=20). Während des Versuchszeitraumes von 70 Tagen erfolgten wöchentliche Blutentnahmen. Es wurden 10 Versuchstiere geschlachtet und Gewebeproben aus Jejunum, Ileum, Caecum und Colon entnommen. Im Weiteren wurden ausgewählte mikrobielle Parameter in Chymus bestimmt und ein Differential- bzw. kleines Blutbild erstellt. Die Quantifizierung der mRNA Expression der Zytokine TNFa, IL-1b, IL-6, IL-10 und diversen Wachstums- und Apoptosefaktoren erfolgte über eine quantitative one-step real-time RT-PCR. Veränderungen der Kryptentiefen, Darmzottenlängen und Flächen der Peyerschen Platten wurden histologisch mittels HE Färbung beurteilt.
Nach oraler Administration von LF konnten signifikante Flächenzunahmen der Lymphfollikel im Ileum (p<0,05) sowie eine Abnahme der Darmzottenlängen im Jejunum gemessen werden (p<0,01). Die Verkürzung der Darmzotten steht vermutlich in Zusammenhang mit der gesteigerten Apoptoseaktivität im Jejunum. In den ersten 6 Lebenswochen konnte ein signifikanter mRNA Anstieg der Zytokine IL1?

Einfluss einer synbiotischen Fütterung mit Lactulose und Enterococcus faecium auf die Darmgesundheit bei Milchkälbern
Fleige, S.; Preißinger, W.; Meyer, H.H.D.; Pfaffl, M.W.: Abstractband „Milchkonferenz 2005“ der Deutschen Gesellschaft für Milchwissenschaft, 29.-30.09.2005, Kiel, S. 47-48
Lactulose in der Kälbermast–Auswirkungen auf Futteraufnahme und Leistungsparameter
Preißinger, W.; Pfaffl, M.W.; Obermaier, A.; Hitzlsperger, L.:
BOKU Tagung 2005, Wien, Österreich, Tagungsband
Durch die Fütterung kann die Kompetenz des Immunsystems beeinflusst und somit auch die Pathogenese von Erkrankungen teils erheblich moduliert werden. Vor dem Hintergrund des Verbots antibiotischer leistungsfördernder Futterzusätze stellt die synbiotische Fütterung mit darmstabilisierender Wirkung eine besondere Herausforderung für die Forschung dar. Im Mittelpunkt unserer Arbeit stehen die synbiotischen Wirkungen von Lactulose und Enterococcus faecium und die vermittelte Immunmodulation in verschiedenen Darmabschnitten. Im Rahmen der durchgeführten Forschungsarbeit wurden 42 Fleckviehkälber in drei isokalorischen Fütterungsgruppen gehalten. Der Milchaustauscher (MAT) wurde mit unterschiedlichen Lactulose Konzentrationen angereichert: Kontrolle, 1% TS (LAC1) und 3% TS (LAC3) Lactulose. Die synbiotische Wirkung wurde durch die zusätzliche Gabe von 1 Mrd. KBE Enteroc occus faecium pro kg MAT erreicht. Nach einem Versuchszeitraum von 19 Wochen wurden Gewebeproben aus dem Darm (Jejunum, Ileum, Caecum, Colon sowie mesenterialer Lymphknoten) entnommen und histologisch mittels HE-Färbung untersucht. Die Behandlung mit Lactulose führte zu signifikant morphologischen Veränderungen. Es zeigte sich ein Reduktion der Zottenlänge im Ileum der Gruppe LAC1 und LAC3 (p = 0.015). Im Weiteren kam es zu einer Verkleinerung der Lymphfollikel (p = 0.044) weiblicher Tiere im Ileum der LAC1 und LAC3 Gruppen. Bei der LAC1 Gruppe wurde die Kryptentiefe im Caecum signifikant (p = 0.016) verringert. Ein Erklärungsansatz dieser Ergebnisse könnte die Bildung von kurzkettigen Fettsäuren (z.B. Butyrat) beim Abbau von Lactulose durch probiotische Bakterien sein. Butyrat erhöht die Apoptose-und verringert die Proliferationsrate, was zu einer Verkürzung der Zotten und einer Verringerung der Kryptentiefe führen könnte. Der Frage inwieweit Lactulose und Enterococcus faecium sich auf die Immunmodulation und auf die Apoptose in verschiedenen Darmabschnitten auswirkt, soll in weiteren Untersuchungen nachgegangen werden. mRNA Expressionsuntersuchungen der wichtigsten immunrelevanten und Apoptose regulierenden Faktoren sollen mittels real-time qRT-PCR quantifiziert werden und die histologischen Ergebnisse in ihrer Aussage stärken. 

Effekte von EGCG und Katechin auf die mRNA Expression pro-inflammatorischer Zytokine in weißen Blutzellen
Effects of varied EGCG and (+)-catechin concentrations on pro-inflammatory cytokines mRNA expression in ConA stimulated primary white blood cell cultures
Sehm, J.; Polster, J.; Pfaffl, M.W.:
Journal of Agricultural and Food Chemistry 53 (2005) S. 6907-6911
EGCG (Epigallocatechin-Gallate) und Catechin sind Flavanoide die als sehr gesund anerkannt werden und für ihre anti-kanzerogen Wirkungen bekannt sind. In Äpfeln, grünem Tee und in Rotwein finden sich hohe Konzentrationen dieser Polyphenole. In früheren wissenschaftlichen Studien wurden die Effekte der Flavanoide in erster Linie in stabilen Zellkulturlinien getestet aber bis dato noch nie in primären Zellkulturen. In dieser Studie haben wir die immunstimulierenden Effekte vom T-Zell Mitogen ConA auf Leukozyten, unter dem Einfluss unterschiedlicher physiologischer EGCG und Catechin Konzentrationen untersucht.
Die Leukozyten wurden aus Rinderblut isoliert und mit RPMI Medium, FCS und Gentamycin kultiviert (1x106 cells/ml). Unterschiedliche Szenarien unter dem Einfluss verschiedener physiologischer Flavanoid Konzentrationen wurden getestet (0, 0.1, 1, 10, 30 und 100 mM). Die Leukozyten konnten nach eintägiger Behandlung geerntet und die total RNA isoliert werden. Die relativen Expressionslevel verschiedener Markerzytokine mRNAs (TNFa, IL1b, IL6, Transkriptionsfaktor cFos, and Histon) konnten mittels real-time qRT-PCR im LightCycler quantifiziert werden. Die Expression wurde mit dem Referenzgen GAPDH normalisiert.
Zusammenfassend kann man sagen, dass beide Flavanoide präventive Effekte in der Aktivierung relevanter Zytokine und Transkriptionsfaktoren zeigen. Höhere Flavanoid Konzentrationen hatten ausgeprägtere Effekte, wobei EGCG mehr expressions-suppressive Effekte aufzeigte.
Einsatz der cDNA-Array-Technologie zur Identifizierung Zink-sensitiver Gene in-vitro Effects of increased cellular zinc levels on gene and protein expression in HT-29 cells Kindermann B.; Döring, F.; Fuchs, D.; Pfaffl, M.W.; Daniel, H.:
BioMetals 18 (2005) S. 243-253
Das lebensnotwendige Spurenelement Zink wirkt als Cofaktor von mehr als 300 Enzymen und ist ein Stabilisator biologischer Membranen. Zink ist außerdem Bestandteil von Transkriptionsfaktoren. Es greift somit in die Regulation der Genexpression ein. Während in Modellorganismen wie z. B. Saccharomyces cerevisiae zahlreiche Zink-sensitive Gene identifiziert wurden, sind beim Säuger bisher nur wenige Gene als Zink-abhängig beschrieben worden. Möglicherweise sind die genutzten Methoden wie z. B. differential display zu unempfindlich, um umfangreiche Daten zur Zink-abhängigen Expression einzelner Gene zu erhalten. Wir haben deshalb geprüft, ob die cDNA-Array-Technologie geeignet ist, Zink-abhängige Säugergene zu identifzieren. Als in-vitro Modellsystem dienten intestinale Epithelzellen (HT-29), die für 72 Std. in einem Medium mit normaler (0.25 ppm) bzw. erhöhter (10 ppm) Zinkkonzentration kultiviert wurden. Die gewählten Bedingungen führten zur drastischen Veränderung der Expression eines bereits bekannten Zink-sensitiven Gens (Metallothionein-1). Zum Screening dienten cDNA-Arrays (Clontech), die mit radioaktiv-markierten cDNAs aus den kultivierten Zellen (0.25 versus 10 ppm Zink) hybridisiert wurden. Die Arrays wurden mittels Phosphorimager ausgelesen und die Signale auf zwei Housekeeping-Gene (GAPDH, ß-Actin) bezogen. Die Auswertung zeigte, dass durch die erhöhte Zinkkonzentration ~1% der repräsentativen Säugergene (1176) in ihrer Expression verändert (> 1.6-fach) sind. Mittels Northern Blot-Analyse und real-time qRT-PCR konnte für ausgewählte Gene die Modulation der Expression verifiziert werden. Die identifizierten Gene codieren u. a. für ein Oberflächenantigen und Proteasomproteine. Das Genprodukt und die Funktion eines Gens (Hypothetical 40 kDa Protein) sind bisher nicht bekannt. Das etablierte Reporterzellsystem und die cDNA-Array-Technologie sind somit prinzipiell geeignet, Zink-abhängige Säugergene zu identifizieren Effekte aufzeigte.

Forschung 2005

III. Reproduktionsbiologie

Darstellung der Genexpression des Rinderendometriums während des östrischen Zyklus – Nachweis von molekularen Pfaden, die an funktionellen Veränderungen beteiligt sind
Gene expression profiling of bovine endometrium during the oestrous cycle: detection of molecular pathways involved in functional changes
Bauersachs, S.; Ulbrich, S.E.; Gross, K.; Schmidt, S.E.; Meyer, H.H.D.; Einspanier, R.; Wenigerkind, H.; Vermehren, M.; Blum, H.; Sinowatz, F.; Wolf, E.:
Journal of Molecular Endocrinology 34 (2005) S. 889-908
Die Untersuchung des Transkriptoms ist geeignet, um neue, an der Regulation beteiligte Gene zu entdecken. Mit Hilfe von subtraktiven cDNA-Bibliotheken und Array-Hybridisierungen konnten 135 Markergene gefunden werden, die im Endometrium des Rindes während des Zyklus reguliert waren. Darüber hinaus wurden solche Gene beschrieben, deren Expression in verschiedenen Abschnitten des Uterus einen Gradienten beschrieben. Von den gefundenen bekannten Genen waren viele an der TGF-b Signalkaskade beteiligt. Diese und weitere Kandidatengene können anschließend Ausgangspunkt für weitere grundlegende Untersuchungen sein, um die komplexen Mechanismen der Regulation der embryo-maternalen Kommunikation genauer zu verstehen.

Regulation des endometrialen Fibroblastenwachstumsfaktors 7 (FGF-7) und seines Rezeptors FGFR2IIIb in Schweinen nach Substitution mit Sexualsteroiden, während des Zyklus und früher Trächtigkeit
Regulation of endometrial fibroblast growth factor 7 (FGF-7) and its receptor FGFR2IIIb in gilts after sex steroid replacements, and during the estrous cycle and early gestation
Wollenhaupt, K.; Welter, H.; Brussow, K.P.; Einspanier, R.:
Journal of Reproduction and Development 51 (2005) S. 509-519
Ziel dieser Studie war es, die Expression des Fibroblasten-Wachstumsfaktors FGF-7 und seines Rezeptors FGFR2IIIb am Tag 12 und 20 des Zyklus (physiologisch niedrige und hohe Plasma Östradiol- und Progesteronkonzentrationen) unter exogener Steroidsubstitution durch Estradiolbenzoat (EB) und Progesteron (P4) sowie am Tag 1 und 12 der Frühgravidität im porcinen Endometrium zu erfassen. Es konnte gezeigt werden, dass die mRNA von FGF-7 und FGFR2IIIb unterschiedlich durch exogene Steroidsubstitution reguliert wird. Während FGF-7 durch P4 und eine bestimmte Menge EB aufreguliert wird, wird FGFR2IIIb durch EB inhibiert. Ligand- und Rezeptortranskript waren erhöht während hoher P4 Werte, also am Tag 12 des Zyklus und der Trächtigkeit. Das FGF-7 Protein wurde lokalisiert im endometrialen Epithel, in glatten Muskelzellen sowie im Endothel unterschiedlicher Blutgefäße und zeigte die stärkste Expression unter EB+P4 sowie am Tag 12 der Gravidität. Die Daten lassen vermuten, dass offensichtlich beide Steroide an der Regulation dieses Ligand-Rezeptor-Systems beteiligt sind und womöglich eine wichtige Rolle bei der Vorbereitung des Endometriums auf eine bevorstehende Implantation spielen.

Ovar Funktion bei Wiederkäuern
Ovarian function in ruminants
Berisha, B.; Schams, D.:
Domestic Animal Endocrinology 29 (2005) S. 305-317

In vivo Beweise für die erhöhte lokale Cortisolproduktion in preovulatorischen Follikeln beim Rind
In vivo evidence that local cortisol production increases in the preovulatory follicle of the cow
Acosta, T.J.; Tetsuka, M.; Matsui, M.; Shimizu, T.; Berisha, B.; Schams, D.; Miyamoto, A.:
The Journal of Reproduction and Development 51 (2005) S. 483-489

Luteolyse des Rindergelbkörpers – ein komplexes Phänomen
Berisha, B.; Meyer, H.H.D.; Schams, D.:
Vortragstagung DGfZ und GfT am 21./22. September 2005, Humboldt-Universität Berlin, Proceedings B17 (2005) S. 1-4
Ziel der vorliegenden Arbeiten war es lokal im Ovar des Rindes produzierte regulatorische Faktoren über den gesamten Brunstzyklus und während induzierter Luteolyse zu charakterisieren, um so Prozesse wie Selektion und Dominanz des Follikels, Ovulation und Gelbkörper-Bildung und -Funktion, sowie die Luteolyse besser zu verstehen. Dazu wurden Corpora lutea verschiedener Zyklusstadien (Tag 1-2, 3-4, 5-7, 8-12, 13-18 und >18) sowie früh- und spätgravider Kühe gesammelt. Für Untersuchungen zur induzierten Luteolyse wurden Kühen am Zyklustag 8-12 Corpora lutea vor und 2, 4, 12, 48 und 64 h nach i.m. Applikation von 500 µg Cloprostenol (PGF2a Analogon) mittels transvaginaler Ovarektomie entnommen. Mit Hilfe der konventionellen Block-PCR, sowie der real-time RT-PCR wurde die mRNA Expression der verschiedenen Faktoren bestimmt. Außerdem wurde die Protein Expression dieser Faktoren durch RIA, EIA, Western Blot und Immunhistochemie im Gewebe untersucht.
Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass lokal produzierte Wachstumsfaktoren, Zytokine und vasoactive Peptide wichtige regulierende Funktionen im Ovar des Rindes während des Follikelwachstums, der Gelbkörper-Anbildung, -Entwicklung und -Funktion haben.

Forschung 2005

IV. ABC Transporter: Bedeutung in Human- und Tierphysiologie

In den letzten Jahren erlangte die Identifikation und funktionelle Charakterisierung von ATP-Binding Cassette (ABC) Transportern eine herausragende Bedeutung. ABC Transporter spielen eine wichtige Rolle in diversen physiologischen Prozessen wie z.B. dem Transport von Sterolen, Phospholipiden, Gallensalzen und Peptiden, oder etwa dem Ausschleusen von Toxinen oder therapeutischen Wirkstoffen aus der Zelle. Mutationen, die eine beeinträchtigte oder fehlende Funktion dieser Proteinen zur Folge haben, können unter anderem zu humanen Erbrankheiten wie Zystische Fibrose (CFTR), Tangier-Krankheit oder erblich bedingte HDL-Defizienz (ABCA1), Stargardt-Erkrankung (ABCA4) oder Immundefizienzen (ABCB2, ABCB3) führen. Im Rahmen unserer Forschungsarbeiten mit ABC Transportern lag unser Schwerpunkt bisher im Bereich der humanen Erkrankungen. Die hier aufgebaute Kompetenz war die Basis für erste Arbeiten im Bereich Lebensmittel liefernder Tiere. Die Identifikation von ABC-Transportern im Rind und deren Expression in der Milchdrüse (Publikationen im Druck) eröffnen die Perspektive den Cholesterintransport auch hier zu verstehen.

Beeinflussung von mRNA Expression von Genen auf Lipidfluss und Matrixdegradation bezüglich arteriosklerotischen Erkrankungen
mRNA expression of genes involved in lipid efflux and matrix degradation in occlusive and ectatic atherosclerotic disease
Soumian, S.; Gibbs, R.; Davies, A.; Albrecht, C.: Journal of Clinical Pathology 58 (2005) S. 1255-1260
ABCA1 ist unter anderem im zellulären Export von Cholesterin aus peripheren Zellen und dem sog. ‚Reversen Cholesterin Transport’ involviert. Während bisherige Untersuchungen sich vorwiegend auf das Studium von Mutationen bezogen, die eine beeinträchtigte ABCA1 Funktion zur Folge haben, konzentrierten sich unsere Untersuchungen auf die Rolle von ABCA1 in Erkrankungen des arteriosklerotischen Formenkreises. Hierbei untersuchten wir die mRNA und Protein-Expresssionen von ABCA1, sowie Genen wie LXRa und PPARy, die in der Regulierung von ABCA1 eine wichtige Rolle spielen. Ferner verglichen wir unterschiedliche arteriosklerotische Krankheitsbilder wie die okklusive und die ektatische Arteriosklerose und bestimmten weitere Faktoren wie COX2 und MMP9, die in der Instabilität von arteriosklerotischen Plaques eine wichtige Rolle spielen.
In den Studien wurden Karotidarterienproben mit arteriosklerotischen Plaques von 16-18 Patienten sowie Aneurysmengewebe von 16 Patienten eingesetzt. Als Kontrolle dienten makroskopisch nicht-arteriosklerotische mesenteriale Arterien von Koloektomie-Patienten. Nach RNA- und Proteinextraktion wurden von allen o. g. Genen mittels quantitativer PCR die mRNA Konzentrationen sowie mittels Immunoblotting die ABCA1 Proteinexpression bestimmt.
Die mRNA Analysen ergaben eine signifikant erhöhte ABCA1 und LXRa Expression in arteriosklerotischen Plaques gegenüber Kontroll- und Aneurysmengeweben. Die PPARy Expression war in beiden arteriosklerotischen Erkrankungen signifikant gesenkt, die MMP9 Expressionen hingegen deutlich erhöht. Die COX2 Konzentrationen waren erhöht in Aneurysmen-, dagegen erniedrigt in Plaquegewebe. In beiden Erkrankungsformen waren die ABCA1- und MMP9 mRNA-Expressionen positiv korreliert. In Plaques wurde eine positive Assoziation zwischen ABCA1 und LXRa gefunden. Trotz erhöhter mRNA Expression war die ABCA1 Proteinkonzentration in Plaquegeweben signifikant reduziert.
Diese Studien zeigen, dass sowohl das ABCA1 Gen wie auch das ABCA1 Protein in humanen Arterien nachweisbar sind. Trotz signifikanter Aufregulierung der ABCA1 mRNA Expression, wahrscheinlich induziert über LXRa, ist die Expression von ABCA1 Protein in arteriosklerotischen Plaques signifikant erniedrigt. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die lokale Umgebung im Bereich des arteriosklerotischen Plaques zu einer differenzierten ABCA1 Expression beiträgt und die erniedrigten ABCA1 Proteinkonzentrationen einen wichtigen Faktor in der Entwicklung von arteriosklerotischen Läsionen darstellt. Weiterhin lassen unsere Studien darauf schließen, dass eine therapeutische Aufregulierung von PPARy, die möglicherweise den Lipidefflux via ABCA1 erhöhen und über MMP9 die Matrixdegradation erniedrigen könnte, in arteriosklerotischen Erkrankungen von Nutzen sein könnte.

Eine neue missense-Mutation in ABCA1 resultiert in verändertem Proteintransport und erniedrigter Phosphatidylserin-Translokation in einer Patientin mit Scott Syndrom
A novel missense mutation in ABCA1 results in altered protein trafficking and reduced phosphatidylserine translocation in a patient with Scott syndrome
Albrecht, C.; McVey, J.H.; Elliott, J.I.; Sardini, A.; Kasza, I.; Mumford, A.D.; Naoumova, R.P.; Tuddenham, E.G.D.; Szabo, K.; Higgins, C.F.:
Blood 106 (2005) S. 542-549
Bei Scott Syndrom handelt es sich um eine seltene Blutungserkrankung, die dadurch charakterisiert ist, dass Phophatidylserin (PS), das in der Zellmembran lokalisiert ist, nach Stimulation nicht zur Zelloberfläche gelangen kann. Da ABCA1 in früheren Studien mit PS-Translokation in Verbindung gebracht wurde, untersuchten wir die Rolle dieses Proteins in der Pathophysiologie einer Patientin mit Scott Syndrom. Hierfür analysierten wir mittels quantitativer PCR die ABCA1 mRNA Expression in frisch isolierten Leukozyten der Patientin und sequenzierten die komplette kodierende sowie proximale Promotor Region des ABCA1 Gens. Wir fanden stark erniedrigte ABCA1 mRNA Konzentrationen in Leukozyten der Patientin und entdeckten eine neue heterozygote missense-Mutation in Position c.6064G>A, die den Aminoaustausch R1925Q zur Folge hat. Diese Aminosäuresubstitution wurde in keinem der nahen Familienangehörigen der Patientin gefunden. WAVE-Analysen zur Detektion von Polymorphismen ergaben, dass diese Mutation auch in einer Kontrollpopulation nicht vorkommt. Differentielle mRNA Analysen an dem gesunden und dem mutierten Allel der Patientin ergaben, dass beide Allele in ihrer ABCA1 mRNA Konzentration erniedrigt waren. Da für dieses Phänomen keine Mutation im ABCA1 Gen bzw. in der proximalen Promoterregion gefunden wurde, liegt die Vermutung nahe, dass in der Patientin noch eine weitere, bisher noch nicht identifizierte Mutation existiert. Diese Mutation betrifft voraussichtlich ein Gen, das in der Regulation von ABCA1 eine Rolle spielt. Um aufzuzeigen, dass die R1925Q Mutation eine kausale Rolle für den Phenotyp der Scott Syndrome Patientin spielt, klonierten wir wildtyp und mutierte ABCA1 cDNA zusammen mit eGFP in Expressionsvektoren und transfizierten die jeweiligen Konstrukte in HEK293 Zellen. Diese in vitro Expressionsstudien zeigten einen deutlich gestörten Transport des mutierten ABCA1 Konstruktes zur Plasmamembran. Um eine Beeinträchtigung des mutierten ABCA1 Proteins hinsichtlich seiner Funktion nachzuweisen, wurde mittels retroviraler Transduktionstechnik wildtyp ABCA1 in EBV-transformierte B-Lymohozyten der Scott Syndrom Patientin exprimiert. Die Überexpresssion von ABCA1 Protein stellte in den Lymphozyten der Patientin die Ca2+-abhängige PS-Translokation an die Zelloberfläche wieder her. Diese Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass die R1925Q Mutation zum Phänotyp der gestörten PS Translokation in der Scott Syndrom Patientin beiträgt.

Forschung 2005

 

© Lehrstuhl für Tierphysiologie und Immunologie    

    Letzte Änderung: 29.10.2015