Persönlicher Status und Werkzeuge

Sprachwahl

Forschungsaktivitäten 2004

I.    Laktationsphysiologie

II.   Lebensmittelsicherheit, Ernährung und Umwelt

III. Reproduktionsbiologie

IV.  Bioanalytik

Zurück zu Forschung / Research

I. Laktationsphysiologie

mRNA expression of apoptosis-related in mammary tissue and milk cells in response to lipopolysaccharide challenge and during subclinical mastitis
Didier, A.; Bruckmaier, R.M.:
Milk Science International 59 (2004) S. 119-123
In der Untersuchung wurde die Regulation der Immunabwehr in der frühen Phase einer Mastitis untersucht. Durch eine neu entwickelte und äußerst schonende Biopsie-Methode konnten in Intervallen von 3 Stunden wiederholte Eutergewebeproben entnommen werden. Durch die quantitative real-time RT-PCR war es möglich, trotz kleinster Probenmengen (20-40 mg Gewebe) die mRNA-Expression einer Vielzahl von Fakturen zu messen. Der Tumornekrosefaktor a (TNFa) erreichte bereits 3 Stunden nach der Stimulation sein höchstes Expressionsniveau, während die mRNA Expression von Lactoferrin, Lysozym und induzierbarer Stickoxidsynthetase (iNOS) ebenfalls anstieg, aber erst nach 6 Stunden ihr Maximum erreichte. Auch die Expression mehrerer anderer Entzündungsmediatoren stieg infolge der Stimulation an, allerdings geringer als die der oben genannten. Außerdem kam es zu einem deutlichen Anstieg zentraler Faktoren (Caspasen, FAS, FAS-Ligand), die die Apoptose (= programmierter Zelltod) der Milchdrüsenzellen steuern. So ist es nicht erstaunlich, dass die Expression zentraler Milchproteine wie des a-Lactalbumin, das über die Steuerung der Lactose-Synthese unmittelbar mit der Milchmengenleistung korreliert ist, und die Expression des k-Caseins infolge der Endotoxin-Stimulation innerhalb weniger Stunden abnahmen.

Anpassungsvermögen individueller Kühe an ein automatisches Melksystem nach der Umstellung vom konventionellen Melkstand
Coping capacity of dairy cows during the change from conventional to automatic milking
Weiss, D.; Helmreich, S.; Möstl, E. ; Dzidic, A.; Bruckmaier, R.M.:
Journal of Animal Science 82 (2004) S. 563-570
Nach der Neuinstallation von automatischen Melksystemen führt die Umstellung von Kühen vom konventionellen zum automatischen Melken während laufender Laktation häufig zu Leistungseinbußen, die nachfolgend kaum mehr kompensiert werden. In der Untersuchung an 17 Kühen variierte die Milchleistung beim ersten automatischen Melken individuell zwischen 8 % und 96 % der erwarteten Milchleistung vor der Umstellung, d.h. dass teilweise erhebliche Störungen der Milchejektion auftreten, während ein Teil der Tiere kaum negativ auf die Umstellung reagiert. Der Grad der Ejektionsstörung nach der Umstellung war umso stärker, je stärker während dieser Melkungen ein Anstieg der Herzfrequenz messbar war. Zusätzlich wurde unabhängig vom Melken bei den Versuchstieren eine Stimulation der Nebennierenrinde (Freisetzung von Cortisol) durch die Injektion von adrenocorticotropem Hormon (ACTH) durchgeführt. Dabei wurde festgestellt, dass die Milchejektionsstörung bei der ersten automatischen Melkung umso stärker war, je weniger Cortisol aufgrund der ACTH-Stimulation freigesetzt wurde. Damit ist aufgrund der ACTH-Stimulation eine Vorhersage möglich, wie sich eine individuelle Kuh an eine Stresssituation anpasst. 

Auswirkungen einer chronischen Ocytocinanwendung auf die endogene Ocytocinfreisetzung und die Milchejektion
Effects of oxytocin administration on oxytocin release and milk ejection
Macuhova, J.; Tancin, V.; Bruckmaier, R.M.:
Journal of Dairy Science 87 (2004) S. 1236-1244
Der chronische Einsatz von Ocytocin beim Melken führt zu Störungen der Milchejektion und zu reduzierten Gemelksmengen, wenn die Ocytocinbehandlung abgesetzt wird. Ziel der vorliegenden Studie war es, die pathophysiologischen Ursachen für diese Ejektionsstörungen zu untersuchen. In den Experimenten wurde Ocytocin im Blutplasma analysiert, sowie der Intramammärdruck und der Milchfluss aufgezeichnet. Es wurde festgestellt, dass die chronische Ocytocinbehandlung keinen negativen Einfluss auf die Freisetzung von Ocytocin während des Melkens hat. Auch die Milchejektion aufgrund der Ocytocinfreisetzung beginnt beim Melken unverändert. Allerdings entleeren sich in der Regel die Alveolen aufgrund des endogenen Ocytocins nur unvollständig. Nur die sehr hohen Blutkonzentrationen von Ocytocin, wie sie nach der Injektion von Ocytocin zu messen sind, gewährleisten eine vollständige Euterentleerung. Die Ejektionsstörung findet demnach peripher im Euter auf Ebene des Ocytocinrezeptors und der Myoepithelzellen statt. Vor dem Hintergrund dieser Ergebnisse ist der chronische Einsatz von Ocytocin auch bei Ejektionsstörungen und Mastitiden soweit wie möglich einzuschränken.

mRNA Expression von immunologischen Faktoren und Milchproteinen in Milchdrüsengewebe und Milchzellen und ihre Konzentration in der Milch während einer subklinischen Mastitis
mRNA expression of immune factors and milk proteins in mammary tissue and milk cells and their concentration in milk during subclinical mastitis
Schmitz, S.; Pfaffl, M.W.; Miller, M.; Buchberger, J.; Meyer, T.; Sauerwein, H.; Bruckmaier, R.M.: Milk Science International 59 (2004) S. 351-355

Veränderungen der mRNA Expression im Milchdrüsengewebe der Kuh innerhalb von 12 Stunden nach einer Belastung mit E. coli Endotoxin
Short-term changes of mRNA expression of various inflammatory factors and milk proteins in mammary tissue during PLS-induced mastitis
Schmitz, S.; Pfaffl, M.W.; Meyer, H.H.D.; Bruckmaier, R.M.:
Domestic Animal Endocrinology 26 (2004) S. 111-126

Größe der Euterzisterne, Zisternenmilchmenge und Milchejektion bei indischen Murrah-Büffeln
Mammary cisternal size, cisternal milk and milk ejection in Murrah buffaloes
Thomas, C.S.; Svennersten-Saunja, K.; Bhosrekar M.R.; Bruckmaier, R.M.:
Journal of Dairy Research 71 (2004) S. 162-168
Die Einführung des Maschinenmelkens bei Wasserbüffeln gestaltet sich teilweise wegen der damit verbundenen ungenügenden Milchabgabe sehr problematisch. In einer ersten Studie wurde durch Ultraschall die Form und Größe der Euterzisterne untersucht, die Zisternenmilchmenge bestimmt und durch exogenes Ocytocin die Milchejektion ausgelöst. Die Zisternengröße war im Vergleich zu Milchkühen außerordentlich klein. Dementsprechend gering war die Zisternenmilchmenge mit nur ca. 300 g bzw. 5 % Anteil am Gesamtgemelk. Die Milchejektion nach Ocytocinverabreichung erfolgte jedoch ähnlich wie bei Milchkühen innerhalb von weniger als 30 Sekunden. Folglich muss die oft beobachtete verspätete Milchejektion bei Büffeln auf einer verspäteten Freisetzung von Ocytocin beruhen. Durch die Kombination der späten Milchejektion mit den beobachteten geringen Zisternenmilchmengen lassen sich die Probleme beim Maschinenmelken erklären. Abhilfe ist nur über eine ausreichende Vorstimulation zu schaffen, um die Freisetzung von Ocytocin rechtzeitig auszulösen.

Veränderungen physikalisch-chemischer Eutergesundheitsindikatoren während Mastitis und ihre Beeinflussung durch die Milchejektion
Changes of physicochemical indicators during mastitis and the effects of milk ejection on their sensitivity
Bruckmaier, R.M.; Weiss, D.; Wiedemann, M.; Schmitz, S.; Wendl, G.:
Journal of Dairy Research 71 (2004) S. 316-321
In der Studie wurde der Einfluss akuter Mastitis, induziert durch E. coli Endotoxin (LPS) auf die somatische Zellzahl sowie auf die Konzentrationen von Natrium-und Chloridionen und die elektrische Leitfähigkeit in der Milch untersucht. Außerdem wurde der Einfluss der Milchejektion bei der Entnahme von  Vormilchproben auf die selben Parameter ermittelt. Während der Entzündungsreaktion nach LPS-Verabreichung stiegen alle untersuchten Parameter innerhalb von 3 Stunden stark an und erreichten 12 Stunden nach der Verabreichung die höchsten Werte. Während die Ionenkonzentrationen und die elektrische Leitfähigkeit nach ca. 30 Stunden wieder auf das Basalniveau abgefallen waren, blieb die somatische Zellzahl auch 60 Stunden nach der LPS-Gabe noch erhöht. Es wurde gezeigt, dass die Ionenkonzentrationen und die elektrische Leitfähigkeit in Vormilchproben eine gute Vorhersage des Zellzahlniveaus und der Eutergesun dheit erlauben, solange nicht innerhalb von 40 bis 60 s aufgrund der Stimulation durch die Probenahme die Milchejektion erfolgt. Nach erfolgter Milchejektion kam es zu einem leichten Abfall der somatischen Zellzahl. Im Gegensatz dazu wurde während der Milchejektion ein Abfall der Ionenkonzentrationen und der Leitfähigkeit beobachtet, der umso stärker war, je mehr die Werte vor der Ejektion erhöht waren. Damit waren Zellzahlniveau und Eutergesundheitsstatus nach erfolgter Milchejektion durch die physikalisch-chemischen Parameter nicht mehr zu unterscheiden. Bei der Beprobung aller Viertel zur Untersuchung dieser Parameter ist daher zu beachten, dass die Probenahme aller Viertel innerhalb ca. 40 s abschlossen sein muss, um eine optimale Aussagekraft zu erreichen.

Veränderungen physikalisch-chemischer Eutergesundheitsindikatoren während Mastitis und ihre Beeinflussung durch die Milchejektion
Changes of physicochemical indicators during mastitis and the effects of milk ejection on their sensitivity
Bruckmaier, R.M.; Weiss, D.; Wiedemann, M.; Schmitz, S.; Wendl, G.:
Journal of Dairy Research 71 (2004) S. 316-321
In der Studie wurde der Einfluss akuter Mastitis, induziert durch E. coli Endotoxin (LPS) auf die somatische Zellzahl sowie auf die Konzentrationen von Natrium- und Chloridionen und die elektrische Leitfähigkeit in der Milch untersucht. Außerdem wurde der Einfluss der Milchejektion bei der Entnahme von Vormilchproben auf die selben Parameter ermittelt. Während der Entzündungsreaktion nach LPS-Verabreichung stiegen alle untersuchten Parameter innerhalb von 3 Stunden stark an und erreichten 12 Stunden nach der Verabreichung die höchsten Werte. Während die Ionenkonzentrationen und die elektrische Leitfähigkeit nach ca. 30 Stunden wieder auf das Basalniveau abgefallen waren, blieb die somatische Zellzahl auch 60 Stunden nach der LPS-Gabe noch erhöht. Es wurde gezeigt, dass die Ionenkonzentrationen und die elektrische Leitfähigkeit in Vormilchproben eine gute Vorhersage des Zellzahlniveaus und der Eutergesundheit erlauben, solange nicht innerhalb von 40 bis 60 s aufgrund der Stimulation durch die Probenahme die Milchejektion erfolgt. Nach erfolgter Milchejektion kam es zu einem leichten Abfall der somatischen Zellzahl. Im Gegensatz dazu wurde während der Milchejektion ein Abfall der Ionenkonzentrationen und der Leitfähigkeit beobachtet, der umso stärker war, je mehr die Werte vor der Ejektion erhöht waren. Damit waren Zellzahlniveau und Eutergesundheitsstatus nach erfolgter Milchejektion durch die physikalisch-chemischen Parameter nicht mehr zu unterscheiden. Bei der Beprobung aller Viertel zur Untersuchung dieser Parameter ist daher zu beachten, dass die Probenahme aller Viertel innerhalb ca. 40 s abschlossen sein muss, um eine optimale Aussagekraft zu erreichen.

Differenzierung von Leukozyten in Kuhmilch
Differentiation of leukocytes in bovine milk
Sarikaya, H.; Prgomet, C.; Pfaffl, M.W.; Bruckmaier, R.M.:
Milk Science International 59 (2004) S. 581-696
Die somatische Zellzahl der Milch wird als Indikator für den Eutergesundheitsstatus verwendet. Erhöhte Zellzahlen werden im Allgemeinen als Anzeichen für Mastitis betrachtet. Zusätzlich kann die Zusammensetzung der Populationen der somatischen Zellen der Milch eine weitergehende Information liefern, da jeder Zelltyp eine spezifische Funktion in der Immunantwort der Milchdrüse hat. Ziel dieser Studie war die Entwicklung und Validierung einer Färbemethode für die somatischen Zellen der Milch. Daher wurde die panoptische Färbemethode nach Pappenheim für die Differenzierung von somatischen Zellpopulationen aus der Milch optimiert. Die Viertelgemelke von 28 Deutschen Braunvieh x Brown Swiss Kühen wurden hinsichtlich ihrer Zellzahlniveaus in 3 Gruppen eingeteilt. Gruppe 1 bestand aus 12 Proben mit einem Mittelwert von 4.57±0.10, Gruppe 2 aus 8 Proben mit einem Mittelwert von 5.39±0.06 und Gruppe 3 aus 8 Proben mit einem Mittelwert von 6.15±0.07 log10 Zellen/ml. Die Ergebnisse zeigten eine Verteilung von Lymphozyten, Makrophagen und Neutrophilen von 20.9, 45.6 bzw. 33.5% in Gruppe 1, von 11.4, 25.1 bzw. 63.5% in Gruppe 2 und von 3.3, 9.5 bzw. 87.2% in Gruppe 3. Somit konnte gezeigt werden, dass der Anteil von Lymphozyten und Makrophagen mit steigender Zellzahl abnimmt wohingegen der Anteil der Neutrophilen zunimmt.

Die azyklische Periode Post Partum in automatischen und konventionellen Melksystemen
The acyclic period postpartum in automatic and conventional milking
Weiss, D.; Reist, M.; Bruckmaier, R.M.:
Journal of Veterinary Medicine Series A 51 (2004) S. 268-272
Die azyklische Phase nach der Geburt ist bei Kühen durch häufig saugende Kälber gegenüber zweimaligem Melken verlängert. Da beim automatischen Melken vor allem am Beginn der Laktation der Melkfrequenz mit bis zu 4 gegenüber derjenigen beim konventionellen Melken deutlich höher ist, sind auch hier im Vergleich Unterschiede bezüglich der zyklischen Aktivität denkbar. In unserer Studie wurden zweimal wöchentlich Milchproben auf ihren Progesteron-Gehalt untersucht, die von Kühen aus der gleichen Herde stammten, die aber entweder 2 mal täglich im konventionellen Melkstand oder bis zu 4 mal im automatischen Melksystem gemolken wurden. Basierend auf den Progesteron-Profilen unterschieden sich die Behandlungsgruppen nicht bezüglich des Zeitraums bis zu ihrer ersten und zweiten Ovulation und bis zur erfolgreichen Besamung.

 II. Lebensmittelsicherheit, Ernährung und Umwelt

Verbleib von rekombinanten Futtermolekülen während der Verdauung und bakterielle Pansenzusammensetzung bei transgen gefütterten Rindern
Tracing residual recombinant feed molecules during digestion and rumen bacterial diversity in cattle fed transgene maize
Einspanier, R.; Lutz, B.; Rief, St.; Berezina, O.; Zverlov, V.; Schwarz, W.; Mayer, J.:
European Food Research and Technology 218 (2004) S. 269-273
Diese Studie verfolgte die Verdauung von Komponenten in isogenem und transgenem Mais im Gastrointestinaltrakt (GIT) des Rindes, nach der Fütterung von 22 Rindern mit Bt176 Mais über einen Zeitraum von 4 Wochen. Weiterhin wurden für den Vergleich von isogen und transgen gefütterten Tieren 16rDNA Sequenzierungen zur Charakterisierung der Pansenbakterien durchgeführt. Fragmente des Chloroplasten-Genoms, der maisspezifischen invertase- bzw. zein-Gene und des Bt-Toxins (Cry1Ab) wurden in Proben aus dem Inhalt von verschiedenen GIT Abschnitten (Pansen, Labmagen, Dünndarm, Dickdarm) mittels quantitativer real-time PCR analysiert. Vorweg wurden die ursprünglichen Mengen dieser Gene in der Maissilage bestimmt. Während der Verdauung konnte eine signifikante Abnahme, sowohl von allen pflanzlichen Genen und Genfragmenten in Abhängigkeit der Verweildauer festgestellt werden. Die Messung des immunoaktiven Cry1Ab Proteins mittels ELISA ergab eine signifikante Abnahme des Proteins in den untersuchten Darmproben. Es konnte sowohl in allen Inhalten des GIT, als auch im Kot das Cry1Ab Protein gemessen werden. Zum ersten Mal wurde der Einfluss von Cry1Ab Protein des transgenen Mais auf die Population der Pansenflora im Vergleich zum isogenen Mais durch die Analyse von 497 individuellen 16S rDNA Sequenzen untersucht. Prinzipiell konnten spezifische vorherrschende Bakterienspezies in allen Pansenextrakten gefunden werden. Es war kein signifikanter Einfluss der Fütterung von Bt176 Mais auf die Zusammensetzung der Pansenflora nachweisbar. Diese Untersuchung liefert ergänzende Daten zur Degradation von rekombinantem Fremdmaterial aus transgenem Lebens- oder Futtermittel im GIT des Säugetieres.

Mobilität der Wachstumsförderer Trenbolon und Melengestrolacetat in landwirtschaftlichen Böden
Mobility of the growth promoters trenbolone and melengestrol acetate in agricultural soil: column studies
Schiffer, B.; Totsche, K.U.; Jann, S.; Kögel-Knabner, I.; Meyer, K.; Meyer, H.H.D.:
The Science of the Total Environment 326 (2004) S. 225-237
Seit einigen Jahren wächst die Besorgnis über industriell erzeugte Umweltchemikalien, die in dem Verdacht stehen, für eine Vielzahl schädlicher Effekte auf das Hormonsystem von Tieren und möglicherweise auch des Menschen verantwortlich zu sein. Sexualhormone sind dabei von besonderem Interesse, da sie regulatorisch in Entwicklungsprozesse wie z.B. die sexuelle Differenzierung eingreifen können. Sowohl endogene Hormone menschlichen oder tierischen Ursprungs als auch exogene Sexualsteroide, die als Kontrazeptiva bzw. als Anabolika in der Tierhaltung Anwendung finden, werden ausgeschieden und gelangen in die Umwelt. Mit Hilfe von Bodensäulenexperimenten wurde der Transport der synthetischen Wachstumsförderer Trenbolon (TbOH) und Melengestrolacetat (MGA) in landwirtschaftlichen Böden untersucht. Dazu wurden mittels Enzymimmunoassay bzw. HPLC (RP-18) die Hormonkonzentrationen in den Säuleneffluenten sowie die Tiefenprofile ermittelt. Die Bestätigung der Analysenergebnisse erfolgte mittels LC-MS. Bei allen Bodensäulen wurde ein schneller Durchbruch geringer Mengen an TbOH und MGA beobachtet. Dennoch zeigten beide Hormone eine hohe Affinität zur organischen Bodenmaterie, welche dazu führte, dass beide Substanzen stark innerhalb der oberen Schichten der Bodensäulen zurückgehalten wurden. Aufgrund ihrer Durchbruchsverhalten im Modellexperiment ist damit zu rechnen, dass TbOH und MGA unter Feldbedingungen Grundwasser führende Zonen erreichen können.

Charakterisierung der Steroiderezeptorexpression in einer humanen Prostata Karzinom Zelllinie 22RV1 und Quantifizierung der mRNA Regulation von prostataspezifischen Genen durch Androgene
Characterisation of steroid receptor expression in the human prostate carcinoma cell line 22RV1 and quantification of androgen effects on mRNA regulation of prostate specific genes
Hartel, A.; Didier, A.; Ulbrich, S.E.; Wierer, M.; Meyer, H.H.D.:
The Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology 92 (2004) S.187-197
Zahlreiche Untersuchungen haben gezeigt, dass eine Vielzahl anthropogener Chemikalien durch hormonähnliche Wirkungen einen schädigenden Einfluss auf Mensch und Tier haben können. Während bereits eine große Anzahl an östrogen- oder antiöstrogenwirkenden Verbindungen durch etablierte Testsysteme identifiziert werden konnte, ist der Kenntnisstand bei den endokrinen Disruptoren mit einem androgenen oder antiandrogenen Potential weitaus geringer. Der Status des Androgenrezeptors (AR), Östrogenrezeptors a (ERa) und Östrogenrezeptors b (ERb) sowie aller drei Isoformen des Gestagenrezeptors in der 22RV1 Zelllinie wurden auf der mRNA- und Proteinebene analysiert. Mittels real-time RT-PCR konnte mRNA nur vom AR und Glukokortikoidrezeptor b (GluRb) detektiert werden. Nicht nachweisbar war hingegen die mRNA von ERa und ERb, den drei Isoformen des Gestagenrezeptors sowie von GluRa. Der Sequenzvergleich der H-Domäne vom Wild-Typ des humanen AR mit der H-Domäne des humanen AR der Zelllinie 22RV1 zeigte eine Mutation im Codon 874 von CAT, welches für Histidin codiert, zu TAT für Tyrosin. Es wurde aber keine veränderte Ligandenspezifität festgestellt. Für neun „Androgen Regulierte Gene“ (ARG) und prostataspezifische Gene wurde ein sensitives real-time RT-PCR System etabliert. Die Ergebnisse zeigen einen signifikanten Verlauf der mRNA Expression nach einer Behandlung mit den natürlichen Steroiden Dihydrotestosteron (DHT), Testosteron und 19-Nortestosteron. Alle Substanzen zeigen einen deutlichen zeithabhängigen und androgenspezifischen Einfluss auf die Transkription. In dem hier vorgestellten Zellkulturmodel konnte gezeigt werden, dass die Liganden messbare Effekte auf die Expression des ARG auslösen und damit eine selektive Charakterisierung der untersuchten Substanzen aufgrund der Genexpressionsmuster ermöglichen.

Immunmodulatorische Wirkungen von Mykophenolsäure
Effects of mycophenolic acid treatment on the Fc receptor (FcRn) and polymeric immunoglobulin receptor (pIgR) mRNA expression in adult sheep tissues
Dzidic, A.; Mohr, A.; Meyer, K.; Bauer, J.; Meyer, H.H.D.; Pfaffl, M.W.:
Croatian Medical Journal 45 (2004) S. 130-135
Mykophenolsäure (MPS) zeigt immun-suppresive Wirkungen und wird in der Humanmedizin bei Organtransplatationen eingesetzt. In der Landwirtschaft trifft man es oft in schlechten Silagen an. Ziel der Studie war es den Einfluss von MPS auf die Expression von Immunglobulinrezeptoren (FcRN und pIgR) in Wiederkäuern zu untersuchen. Der Rezeptorsubtyp FcRn ist für den Transport der IgGs verantwortlich und pIgR für den trans-zellulären Transport von IgA und IgM. Es wurden 9 gesunde Schafe für 9 Wochen mit 300 mg MPS pro Tier und Tag behandelt und 9 unbehandelten Schafen gegenübergestellt. Nach der Schlachtung der Tiere wurde die mRNA Expression in acht unterschiedlichen Organen (Lebe, Niere, Jejunum, Ileum, Milz, Thymus, mesenterialer und pharyngealer Lymphknoten) bestimmt. Mittels real-time qRT-PCR konnten die beiden Rezeptoren exakt und zuverlässig quantifiziert werden. Jedes Gewebe zeigt ein gewebe-spezifisches Expressionsmuster für jeden Subtypen, dabei wurden extrem hohe Expressionen in der Leber, Niere und im gastro-intestinalen Trakt gemessen. In der Milz, Thymus, und den beiden Lymphknoten konnten mittlere bis niedrige Expressionslevel beider Rezeptoren bestimmt werden. Eine signifikante Abregulation der FcRn mRNA Expression konnte für die Leber (p=0,02) gezeigt werden. Eine signifikante Aufregulation der pIgR mRNA Expression wurde im Ileum (p=0,04) und in de Leber (p=0,04) gefunden. Folgende Reihung der Expressionsstärken wurde für die FcRn mRNA (Leber > Niere > Jejunum > Ileum > Milz > Thymus > mesenterialer Lymphknoten > pharyngealer Lymphknoten) sowie pIgR mRNA gefunden(Leber > Niere > Jejunum > Ileum > pharyngealer Lymphknoten > Milz > Thymus > mesenterialer Lymphknoten). Zusammenfassend ist zu sagen, dass MPS immun-modulatorische Effekte zeigt. Es kann immun-suppresive Wirkungen in der Leber über die verringerte Expression des IgG Rezeptors vermitteln. Das könnte zu einem verminderten Transport der IgGs in die Galle führen. Im Gegensatz unterstützt es den Transport der IgAs und IgMs in der Leber und im Ileum.

III. Reproduktionsbiologie

1) Ovidukt und Uterus

Hyaluronsäure im Rindereileiter – ausgeprägte Regulierung von Synthasen und Rezeptoren während des Zyklus
Hyaluronan in the bovine oviduct – distinct regulation of synthases and receptors during the oestrus cycle
Ulbrich, S.E.; Schoenfelder, M.; Thoene, S.; Einspanier, R.: Molecular and Cellular Endocrinology 214 (2004) S. 9-18

Monitoring der Genexpression in Epithelzellen des Rindereileiters während des Zyklus
Monitoring gene expression changes in bovine oviduct epithelial cells during the oestrous cycle
Bauersachs, S.; Rehfeld, S.; Ulbrich, S.E.; Mallok, S.; Prelle, K.; Wenigerkind, H.; Einspanier, R.; Blum, H.; Wolf, E.: Journal of Molecular Endocrinology 32 (2004) S. 449-466
Der Eileiter spielt eine zentrale Rolle für den Transport und die Reifung der unbefruchteten Eizelle und der Spermien; auch die ersten Tage der frühen embryonalen Entwicklung finden im Eileiter statt. Während des Zyklus finden ausgeprägte morphologische und funktionelle Veränderungen statt, die hauptsächlich durch die Sexualhormone gesteuert werden. Im Mittelpunkt der Untersuchungen am Eileiter steht daher die Frage, welche Faktoren dazu beitragen, eine erfolgreiche Befruchtung zu ermöglichen.  Einen wesentlichen Beitrag hierzu leistet vermutlich Hyaluronsäure (HA). Dieses Mukopolysaccharid, dessen Rezeptoren (CD44, RHAMM, HARE) und die HA-synthetisierenden Enzyme (HAS2, HAS3) konnten mittels real-time RT-PCR bzw. Immunhistochemie im Rindereileiter identifiziert werden. Der Nachweis unterschiedlicher Konzentration an mRNA und Protein in den verschiedenen Kompartimenten des Eileiters (Ampulle und Isthmus sowie Stroma und Epithel) gibt Hinweise auf mögliche Interaktionen, u.a. mit den Eizellen, den Spermien und dem Embryo.  Darüber hinaus konnten mit Hilfe von subtraktiven cDNA-Bibliotheken und Array-Hybridisierungen 77 Markergene gefunden werden, die im Eileiterepithel während der beiden Zykluszeitpunkte Östrus und Diöstrus signifikant reguliert waren. Die Untersuchung des Transkriptoms ist geeignet, um neue, an der Regulation beteiligte Gene, zu entdecken. Während des Östrus waren vor allem solche Gene aufreguliert, die an der Proteinsekretion und –modifikation beteiligt sind (z.B. TRA1, GRP78, ERP70). Gene, die an der Regulation der Transkription beiteiligt sind, waren während der Gelbkörperphase leicht erhöht. Mit Hilfe der sensitiven real-time RT-PCR konnte die Genexpression exakt quantifiziert werden. Die Array-Technik und die real-time RT-PCR ergaben sehr gute Korrelationen (r>0,92) der Ergebnisse. Diese und weitere Kandidatengene können anschließend Ausgangspunkt für weitere grundlegende Untersuchungen sein, um die komplexen Mechanismen der Regulation genauer zu verstehen.

Monitoring der Genexpression in Epithelzellen des Rindereileiters während des Zyklus
Monitoring gene expression changes in bovine oviduct epithelial cells during the oestrous cycle
Bauersachs, S.; Rehfeld, S.; Ulbrich, S.E.; Mallok, S.; Prelle, K.; Wenigerkind, H.; Einspanier, R.; Blum, H.; Wolf, E.: Journal of Molecular Endocrinology 32 (2004) S. 449-466

Monitoring gene expression changes in bovine
oviduct epithelial cells during the oestrous cycle
S Bauersachs, S Rehfeld, SE Ulbrich1, S Mallok2, K Prelle, H Wenigerkind3, R Einspanier1, H Blum2 and E Wolf
Institute of Molecular Animal Breeding, Ludwig Maximilians University, Feodor-Lynen-Str. 25, 81377 Munich, Germany
1Institute of Physiology, Technical University of Munich, Weihenstephaner Berg 3, 85354 Freising, Germany
2Gene Centre of the Ludwig Maximilians University, Feodor-Lynen-Str. 25, 81377 Munich, Germany
3Bavarian Research Centre for Biology of Reproduction, Hackerstr. 27, 85764 Oberschleissheim, Germany
(Requests for offprints should be addressed to E Wolf; Email: ewolf@lmb.uni-muenchen.de)
(K Prelle is now at CRBA Gynecology & Andrology, Schering AG, Muellerstr. 178, 13442 Berlin, Germany)
(R Einspanier is now at Institute of Veterinary Biochemistry, Free University of Berlin, Oertzenweg 19b, 14163 Berlin, Germany)
Abstract
The oviduct epithelium undergoes marked morphological and functional changes during the oestrous
cycle. To study these changes at the level of the transcriptome we did a systematic gene expression
analysis of bovine oviduct epithelial cells at oestrus and dioestrus using a combination of subtracted cDNA
libraries and cDNA array hybridisation. A total of 3072 cDNA clones of two subtracted libraries were
analysed by array hybridisation with cDNAprobes derived from six cyclic heifers, three of them slaughtered
at oestrus and three at dioestrus. Sequencing of cDNAs showing significant differences in their expression
levels revealed 77 different cDNAs. Thirty-seven were expressed at a higher level at oestrus, for the other
40 genes expression levels were higher at dioestrus. The identified genes represented a variety of
functional classes. During oestrus especially genes involved in the regulation of protein secretion and
protein modification, and mRNAs of secreted proteins, were up-regulated, whereas during dioestrus
particularly transcripts of genes involved in transcription regulation showed a slight up-regulation. The
concentrations of seven selected transcripts were quantified by real-time RT-PCR to validate the cDNA
array hybridisation data. For all seven transcripts, RT-PCR results were in excellent correlation (r>0·92)
with the results obtained by array hybridisation. Our study is the first to analyse changes in gene expression
profiles of bovine oviduct epithelial cells during different stages of the oestrous cycle, providing a starting
point for the clarification of the key transcriptome changes in these cells.
Journal of Molecular Endocrinology (2004) 32, 449–466

Entwicklungs- und hormonell regulierte Expression des Fibroblastenwachstumsfaktors FGF und seiner Rezeptoren im Endometrium des Schweines
Developmental and hormonal regulated gene expression of fibroblast growth factor 2 (FGF-2) and its receptors in porcine endometrium
Welter, H.; Wollenhaupt, K.; Einspanier, R.:
Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology 88 (2004) S. 295-304

Expression des Epidermalwachstumsfaktorrezeptors, VEGF- und FG-Rezeptor-Systems im Eileiter und Ovidukt des Schweines während des Implantationszeitpunktes
Expression of epidermal growth factor receptor (EGF-R), vascular endothelial growth factor receptor (VEGF-R) and fibroblast growth factor receptor (FGF-R) systems in porcine oviduct and endometrium during the time of implantation
Wollenhaupt, K.; Welter, H.; Einspanier, R.; Manabe, N.; Brussow, K.P.:
Journal of Reproduction and Development 50 (2004) S. 269-278
Ein optimales endometriales Milieu ist entscheidend für eine Trächtigkeit.
Neben den Sexualsteroiden wird Wachstumsfaktoren und Zytokinen eine unterstützende Rolle bei diesem Prozess zugesprochen. Die Erforschung der Syntheseleistung von Fibroblastenwachstumsfaktoren (FGF) und Stickstoffmonoxidsynthasen (NOS) im Endometrium des Schweines und Pferdes auf mRNA und Proteinebene war Gegenstand dieses Projektes. Im Schwein konnte eine hormonelle Regulation dieser beiden Systeme während des Zyklus und der Trächtigkeit nachgewiesen werden. FGF-2, FGF-7, FGFR1 und FGFR2IIIb waren während der Implantationsphase stark exprimiert. Immunhistochemisch wurden FGF-2, FGF-7 und FGFR1 im Epithel, Stroma sowie in Blutgefäßen nachgewiesen.
Im Pferd gelang erstmals der Nachweis dieser beiden Systeme. Es konnte eine zyklus- und trächtigkeitsabhängige Expression dokumentiert werden. Während der Trächtigkeit wurden FGF-2 und FGF-7 im Epithel, der Basalmembran und in Blutgefäßen lokalisiert. Die unterschiedlich starke Expression von Mitgliedern der FGF- und NOS-Familie im Endometrium beider Tierarten deutet auf eine wichtige Rolle für die Gefäßbildung, Blutversorgung und epitheliale sowie stromale Differenzierung des Endometriums hin.

2) Ovar

a) Follikulogenese

Expression und Lokalisation von Mitgliedern der FGF Familie während des Endwachstums von Rinderovarfollikeln
Expression and localization of fibroblast growth factor (FGF) family members during the final growth of bovine ovarian follicles 
Berisha, B.; Sinowatz, F.; Schams, D.:
Molecular Reproduction and Development 67 (2004) S. 162-171

Expression von Mitgliedern der FGF Familie in Rinderovarfollikeln während der periovulatorische Phase
The expression of fibroblast growth factor (FGF) family members in bovine follicles during peri-ovulatory phase
Berisha, B.; Meyer, H.H.D.; Schams, D.:
37.
Jahrestagung über Physiologie und Pathologie der Fortpflanzung gleichzeitig 29. Veterinär-Humanmedizinische Gemeinschaftstagung, München, 19.-20.02.2004. Veterinary Medicine Austria / Wiener Tierärztliche Monatsschrift 91 (2004) S. 10-11
Unsere früheren Untersuchungen haben gezeigt, dass Mitglieder der FGF Familie mit an der Angiogenese, besonders an der vom dominanten Follikel, sowie an der Granulosazellen Funktion und Proliferation beteiligt sind. Ziel der vorliegenden Arbeiten war die Auswertung von zeitlich definierten Follikelproben, gewonnen vor und nach dem LH-Gipfel bis zur Ovulation. Genügend Material für die Studien zur mRNA Expression, Proteinkonzentration und Proteinlokalisation war nur zu erhalten, wenn genügend Follikel zur Verfügung standen. Dies konnte nur mit Hilfe der Superovulation bewerkstelligt werden: Nach Induzierung der Luteolyse mit Prostaglandin (PG), Stimulation des Follikelwachstums mit FSH und 40h nach der PG Applikation von GnRH zur Induktion der Ovulation wurden Follikel bzw. frische CL durch transvaginale Ovarektomie gewonnen (4 – 5 Tiere/Gruppe).
Follikel wurden in folgende Gruppen eingeteilt: (I) Vor GnRH-Injection (vor LH Gipfel); (II) 3-5h nach GnRH (während des LH-Gipfels); (III) 10h nach GnRH; (IV) 20h nach GnRH; (V) 25h nach GnRH (während der Ovulation); (VI) 48-72h nach GnRH (nach der Ovulation; CL Tag 2-3)
Als Charakterisierungsparameter für unsere Follikelgruppen dienten die Spiegel von Östradiol, Progesteron, PGF2a und PGE2 in der FF. Die Ergebnisse zeigten einen typischen Verlauf in der FF mit signifikantem Abfall 10h nach LH für E2 sowie gleichbleibenden niedrigen Progesteronwerten, die erst um die Ovulation deutlich ansteigen. Typischer war der Verlauf der Prostaglandine mit signifikantem Anstieg 20h nach GnRH und weiterem Anstieg um die Ovulation. Die ersten Ergebnisse zeigten eine ausgeprägte mRNA Expression, Proteinkonzentration und deutliche Lokalisationswechsel von FGF2 in Follikelgruppen während der periovulatorischen Phase (vor LH-Gipfel: Lokalisation hauptsächlich in Endothelzellen und Pericyten von Blutgefässen; nach LH-Gipfel: nur im Zellkern von Granulosazellen). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass FGF2 bei der Follikelzelldifferenzierung (Luteinisierung der Granulosazellen in Lutealzellen), sowie Gelbkörperanbildung eine wichtige Rolle spielen kann.

Expression von Mitgliedern des Angiopoietin-Tie Systems in Granulosa Zellen während des Follikelwachstums im Eierstock des Rindes
Expression of mRNA for the angiopoietin-tie system in granulosa cells during follicular development in cows
Hayashi, K.G.; Berisha, B.; Matsui, M.; Schams, D.; Miyamoto, A.:
Journal of Reproduction and Development 4 (2004) S. 477-480
Diese Untersuchungen zeigen, dass die spezifischen Wachstumsfaktoren des Angiopoietin-(ANPT)-Tie-System für das Endwachstum des dominanten Follikels eine wichtige Rolle spielen.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war mRNA Expression von Mitgliedern der Angiopoietin Familie im Follikel des Rindes nachzuweisen. Eine Einteilung der Follikel in fünf Gruppen (<0,5; >0,5-5; >5-20; >20-180; >180 ng/ml) erfolgte nach dem Östradiol-17ß(E2)-Gehalt in der Follikelflüssigkeit (FF). Das Follikelgewebe wurde in Theka interna (TI) und Granulosazellen (GZ) getrennt. Die Follikelklassen wurden zusätzlich durch die mRNA Expression von LH- und FSH-Rezeptoren sowie durch Aromatase charakterisiert.
Die mRNA Expression von ANPT-1 während des Follikelwachstums war ohne regulatorische Änderungen. Im Gegensatz dazu fiel die Expression der ANPT-2 mRNA und die ANPT-2/ANPT-1 Ratio in TI mit dem Follikelwachstum bis zum preovulatorischen Follikel ab. Die Tie-1 und Tie-2 mRNA Expression in der Theka interna stieg signifikant im preovulatorischen Follikel. Die Ergebnisse zeigen komplexe Interaktionen und geben Hinweise für eine wichtige Rolle des Angiopoietin-Tie Systems während dem Follikelendwachstum im Ovar des Rindes.

b) Gelbkörperfunktion und induzierte Luteolyse

Regulation der Corpus Luteum Funktion des Rindes
Regulation of corpus luteum function in cattle – an overview
Schams, D.; Berisha, B.: Reproduction in Domestic Animals 39 (2004) S. 241-251

Expression von Mitgliedern der FGF und VEGF Familie in Endothelzellen vom Corpus Luteum des Rindes nach der Stimulation mit FGF2, VEGF oder Estradiol
Expression pattern of fibroblast growth factor (FGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) system members in bovine corpus luteum endothelial cells during treatment with FGF-2, VEGF or oestradiol
Gabler, C.; Plath-Gabler, A.; Killian, G.J.; Berisha, B.; Schams, D.:
Reproduction in Domestic Animals 39 (2004) S. 321-327
In den letzten Jahren ist deutlich geworden, dass neben den endokrinen Systemen auch autokrine und parakrine Faktoren an dem Komplex der Ovarfunktionsregulation beteiligt sind. Ziel der Arbeiten war es, lokal im Rinderovar produzierte regulatorische Faktoren über den gesamten Brunstzyklus zu charakterisieren, um so Prozesse wie Selektion und Dominanz des Follikels, der Ovulation und CL-Bildung und –Funktion, sowie die Luteolyse besser zu verstehen.
Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass lokal produzierte Wachstumsfaktoren (VEGF, FGF, IGF usw.), Zytokine (TNF, NOS usw.) und vasoactive Peptide (Angiotensin, Endothelin usw.), wichtige regulierende Funktionen im Ovar des Rindes während des Follikelwachstums, sowie während der Gelbkörperbildung, -entwicklung und -funktion übernehmen.

Relative Änderungen der mRNA Expression von Angiopoiet-Tie System im Corpus Luteum des Rindes während Brunstzyklus und induzierter Luteolyse: mögliche Mechanismen für die Einleitung der Regression
Relative changes in mRNA expression for angiopoietin and receptors tie in bovine corpus luteum during estrous cycle and prostaglandin F2alpha-induced luteolysis: a possible role in luteolysis
Tanaka, J.; Acosta, J.T.; Berisha, B.; Tetsuka, M.; Matsui, M.; Kobayashi, S.; Schams, D.; Miyamoto, A.: Journal of Reproduction and Development 50 (2004) S. 619-626

Die Beteiligung von pro-inflammatorischen Zytokinen, Entzündungsmediatoren und des basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors an der PGF2a induzierten Luteolyse des Rindes
Involvement of pro-inflammatory cytokines, mediators of inflammation and basic fibroblast growth factor in PGF2a-induced luteolysis in bovine corpus luteum
Neuvians, T.P.; Schams, D.; Berisha, B.; Pfaffl, M.W.: Biology of Reproduction 70 (2004) S. 473-480

Die Expression von VEGF und FGF während der induzierten Luteolyse im Gelbkörper des Rindes
Vascular endothelial growth factor (VEGF) and fibroblast growth factor (FGF) expression during induced luteolysis in the bovine corpus luteum
Neuvians, T.P.; Berisha, B.; Schams, D.: Molecular Reproduction and Development 67 (2004) S. 389-395
Zahlreiche lokale Faktoren regulieren den Ablauf der PGF2alpha induzierten Luteolyse und sorgen dafür, dass sich der Gelbkörper innerhalb kürzester Zeit ohne entzündliche Reaktion und Funktionsbeeinträchtigung des restlichen Ovars zurückbildet. Ziel der Untersuchungen war es, das Zusammenspiel dieser lokalen Regulationsfaktoren weiter aufzuklären. Dazu wurden Corpora lutea verschiedener Zyklusstadien (Tag 1-2, 3-4, 5-7, 8-12, 13-18 und >18), sowie früh-und spätgravider Kühe gesammelt. Für Untersuchungen zur induzierten Luteolyse wurden Kühen am Zyklustag 8-12 Corpora lutea vor und 2, 4, 12, 48 und 64 h nach i. m. Applikation von 500 ?g Cloprostenol (PGF2 a Analogon) mittels transvaginaler Ovarioektomie entnommen. Mit Hilfe der konventionellen Block-PCR, sowie der real-time RT-PCR wurde die mRNA Expression der verschiedenen Faktoren bestimmt (Mitglieder folgender Wachstumsfaktor Familien: VEGF, FGF, IGF, Angiopoietin, Endothelin, Angiotensin, TNF, NOS, pro-inflammatorische Zytokine usw.). Außerdem wurde durch einen Radioimmunoassay die Proteinkonzentration von VEGF ermittelt. Im Verlauf der Untersuchungen konnte die Isoform A des Insulin-Rezeptors beim Rind bestätigt werden. Die prädominante Expression der Isoform A lässt auf eine bedeutende Rolle für die Übertragung mitogener Effekte des IGF II auf das Wachstum des Gelbkörpers schließen. Die unterschiedliche Expression der beiden Isoformen A und B kann den Einfluss von IGF II und Insulin auf Entwicklung, Aufrechterhaltung und Funktion des Gelbkörpers regulieren. Während das IGF-Bindungsprotein 1 bereits zu Beginn der funktionellen Luteolyse eine ausschlaggebende Rolle zu spielen scheint, ist IGFBP 5 eher an der strukturellen Luteolyse maßgeblich beteiligt. Des weiteren konnte zu Beginn der induzierten Luteolyse ein deutlicher Anstieg pro-inflammatorischer Zytokine (TNFa, IL-1b, IFNg) festgestellt werden, der möglicherweise direkt die Produktion von gelbkörpere rhaltendem Progesteron beeinträchtigt und somit die Rückbildung des Corpus luteum einleitet. Der gleichzeitige Anstieg von bFGF, das die Transkription von Entzündungsmediatoren, wie z.B. iNOS, verhindern kann, mag dazu beitragen, dass trotz des Zytokinanstiegs keine entzündliche Reaktion im Ovar abläuft. Der Anstieg primär Angiogenese fördernder und luteotroper Faktoren, wie z.B. aFGF und bFGF, könnte aber auch Ausdruck einer kurzfristigen Gegenregulation sein, um das Corpusluteum zu erhalten. Während der strukturellen Luteolyse aber werden angiogene Faktoren (VEGF und FGF) vermindert exprimiert, vermutlich im Zusammenhang mit der Degradation von Luteal- und Endothelzellen

IV. Bioanalytik

1. Internationales qPCR Symposium & Application Workshop
www.wzw.tum.de/gene-quantification/qpcr2004/
Pfaffl, M.W.: Proceedings of the 1st International qPCR Symposium & Application Workshop “Transcriptomics, Clinical Diagnostics & Gene Quantification” 03.-06.03.2004, Freising-Weihenstephan, Germany, ISBN 3-00-013404-2, (2004) S. 1-99
Nach der erfolgreichen Entschlüsselung der Genomsequenz des Menschen sowie einiger prominenter pathogener Mikroorganismen liegt ein Schwerpunkt der biomedizinischen Forschung jetzt auf der gezielten Analyse des Zusammenwirkens einzelner Gene bzw. Genprodukte bei den unterschiedlichsten entwicklungsbiologischen, pathogenetischen oder auch pharmakokinetischen Fragestellungen. Aus Sicht der Humanmedizin stehen unter anderem die Aufklärung von Genexpressionsprofilen bei bestimmten Gendefekten, genetisch bedingten Stoffwechselstörungen oder bei der Entstehung von Tumoren sowie der möglichst schnelle und präzise Nachweis von pathogenen Mikroorganismen im Vordergrund. Die qPCR entwickelte sich dabei schnell zu dem zentralen und universell einsetzbaren analytischen Werkzeug der Molekularbiologen.
Nukleinsäure-Amplifikationstechniken (NAT) bieten ein breites Spektrum an Methoden, die für den gezielten Nachweis von Nukleinsäuren entwickelt wurden. In vielen Bereichen der modernen mikrobiologischen Diagnostik erweist sich der Einsatz dieser enorm sensitiven, spezifischen und zumeist auch sehr schnellen Testsysteme als ideale Ergänzung zu konventionellen Untersuchungsverfahren wie Mikroskopie und Zellkultur. Sowohl die ständig zunehmende Zahl von pathogenen Erregern (emerging diseases), die Fortschritte bei der Aufklärung von komplexen Pathogenitätsmechanismen, aber auch die Verbesserung der antibiotischen und antiviralen Medikation zur gezielten Behandlung von Infektionserkrankungen erfordern eine adäquate infektiologische Diagnostik.
Quantitative Verfahren zur in vitro-Amplifikation und Detektion bestimmter Nukleinsäurefragmente und die sequenzspezifische Charakterisierung der Amplifikationsprodukte eröffneten in den letzten Jahren ungeahnte Möglichkeiten eines kulturunabhängigen Erregernachweises. Um die notwendige Reproduzierbarkeit der Untersuchungen zu erzielen, besteht großer Bedarf an der Entwicklung effizienter Probenaufschlussverfahren sowie der Etablierung von geschlossenen und standardisierten Amplifikations- und Detektionsformaten.
Nukleinsäuregestützte Testsysteme werden derzeit in enger Zusammenarbeit von Klinikern und Molekularbiologen für eine Reihe von maßgeschneiderten routinegängigen Anwendungsverfahren entwickelt, mit denen beispielsweise im geschlossenen real-time PCR-Format ein Nachweis von langsam wachsenden oder nicht kultivierbaren Erregern innerhalb weniger Stunden erfolgen kann.
Nach mehr als einem Jahrzehnt intensiver Forschungs- und Entwicklungsarbeit an der eigentlichen Methodik, der permanenten Optimierung einzelner Teilschritte und Reaktionskomponenten sowie der Einbeziehung von Microarray-Technologien finden diese Verfahren derzeit breiten Einzug in die tägliche Praxis der Laboratoriumsmedizin und haben das Potenzial, sich bei vielen diagnostischen Fragestellungen als "Goldstandard" zu etablieren.
Da der Anwender in diesem äußerst dynamischen Umfeld meist einer nahezu unüberschaubaren Vielfalt von erregerspezifischen PCR-Protokollen und Detektionsplattformen gegenübersteht, wurde im Rahmen des Symposiums an ausgewählten Beispielen der mikrobiologischen Praxis das derzeit Machbare, d.h. der "Stand der Technik"

Real-time RT-PCR: Neue Ansätze zur exakten mRNA Quantifizierung
Pfaffl, M.W.: BIOspektrum, Sonderausgabe PCR, 10 (2004) S. 92-95

Quantification strategies in real-time RT-PCR
Pfaffl, M.W.: The real-time PCR Encyclopaedia A-Z of quantitative PCR. International University Line ( Bustin, St. A. ed.), La Jolla, CA, (2004) S. 87-120 

Nucleic acids:  mRNA identification and quantification
Pfaffl, M.W.: Encyclopaedia of Analytical Science, 2nd Edition, (Worsfold, P.J.; Townsend, A.; Poole, C.F., eds.) Elsevier Ltd., Philadelphia, USA, ISBN 0-12-764100-9, (2004) S. 417-426

Comparison of reverse transcriptases in absolute and relative gene expression analysis
Stahlberg, A.; Kubista, M.25; Pfaffl, M.: Clinical Chemistry 50 (2004) S. 1678-1680

Inhibition of real-time RT-PCR quantification due to tissue specific contaminants
Tichopad, A.; Didier, A.; Pfaffl, M.W.:
Molecular and Cellular Probes 18 (2004) S. 45-50

Determination of stable housekeeping genes, differentially regulated target genes and sample integrity: BestKeeper – Excel-based tool using pair-wise correlations
Pfaffl, M.W.; Tichopad, A.; Prgomet, C.; Neuvians, T.P.:
Biotechnology Letters 26 (2004) S. 509-515
Die molekularen Technologien Genomics, Transcriptomics und Proteomics erobern immer mehr die klassischen Forschungsgebiete der Biowissenschaften.
Die enorme Flut an gewonnenen Daten und Ergebnissen ist von überproportionalem Nutzen in der molekularen Diagnostik und Physiologie sowie den „Functional Genomics“. Immer neue ausgeklügelte Methoden und Anwendungen sind daher nötig um komplexe physiologische Vorgänge zu beschreiben. Da wir uns erst am Anfang dieser molekularen Ära befinden, ist es notwendig diese Techniken zu optimieren und komplett zu verstehen.Eine dieser technisch ausgefeilten Methoden zur zuverlässigen und exakten Quantifizierung spezifischer mRNA, stellt die real-time RT-PCR dar. Diese Zusammenfassung beschreibt im wesentlichen die effizienz-korrigierte relative Quantifizierung, die Normalisierung der Expressionsergebnisse anhand eines nicht regulierten „Housekeeping Gens“, die Berechnung der real-time PCR Effizienz sowie die Verrechnung und statistische Auswertung der Expressionsergebnisse.
Einleitung
Die Anwendung der Reversen Transkription (RT) mit folgender Polymerase Kettenreaktion (PCR) zum Nachweis einer spezifischen mRNA ist heute ein Routinewerkzeug in der Molekularbiologie. Der Nachweis kann qualitativ in klassischen RT-PCR Blockcyclern oder quantitativ mittels Echtzeit RT-PCR (real-time RT-PCR oder qRT-PCR) durchgeführt werden. Vorraussetzung für einen zuverlässigen quantitativen Nachweis ist eine funktionierende mRNA Analytik, die exakte mRNA Quantifizierungsergebnisse bei ausreichender Genauigkeit und hoher Wiederholbarkeit liefert. Es stehen zwei generelle Quantifizierungsstrategien in der real-time RT-PCR zur Verfügung (Abb. 1):
- Die absolute Quantifizierung wird anhand einer gegebenen Kalibrierkurve durchgeführt, basierend auf einer Verdünnungsreihe  von RT-PCR Produkten, Plasmid DNA, in vitro transkribierter RNA, synthetisierter DNA oder RNA Oligomere.

 

 

© Lehrstuhl für Tierphysiologie und Immunologie    

    Letzte Änderung: 29.10.2015