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Forschungsaktivitäten 2012

I.   Laktationsphysiologie

II.  Reproduktionsbiologie

III. Lebensmittelsicherheit, Ernährung und Umwelt

IV. Wachstumsphysiologie, myotrope Therapeutika und Anabolika

V.  Bioanalytik

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I. Laktationsphysiologie

Vergleich der Effekte der Frühträchtigkeit mit humanem Interferon alpha 2 (IFNA2) auf die Genexpression im bovinen Endometrium
Comparison of the effects of early pregnancy with human interferon, alpha 2 (IFNA2), on gene expression in bovine Endometrium
Bauersachs, S.4,5,6; Ulbrich, S.E.; Reichenbach, H.-D.7; Reichenbach, M.5,8; Büttner, M.9; Meyer, H.H.D.; Spencer, T.E.10; Minten, M.10; Sax, G.11; Winter, G.11; Wolf, E.5,6: Biology of Reproduction 86 (2012) 1-15
Interferon tau (IFNT), ein Typ I IFN, welches dem IFN alpha (IFNA) ähnlich ist, wird vom bovinen Embryo sezerniert und übernimmt die Funktion der Trächtigkeitserkennung beim Wiederkäuer. Um spezifische Effekte von IFNT gegenüber weiteren embryonalen Signalen zu untersuchen, wurden in dieser Studie die Änderungen der Transkription der Uterusschleimhaut während der frühen Trächtigkeit verglichen mit dem Transkriptom nach intrauteriner Applikation von humanem IFNA2. Die Analyse erfolgte mittels cDNA Hybridisierungsarrays (Affymetrix Bovine Genome Array). Durch den Vergleich der beiden Datensätze konnten solche Gene identifiziert werden, deren Abundanz nur in Anwesenheit vom Embryo bzw. nur in Anwesenheit von IFNA2 verändert waren. Dies deutet darauf hin, dass IFN im Zusammenhang mit der Frühträchtigkeit eine wesentliche Rolle spielt, dass aber der Embryo eine Reihe weiterer spezifischer Signale aussendet, die auf die Funktion der Gebärmutterschleimhaut einen Einfluss haben.

Eine einzelne differentiell methylierte CpG-Stelle korreliert mit der Transkription des Östrogen Rezeptors alpha
A differentially methylated single CpG-site is correlated with estrogen receptor alpha transcription
Fürst, R.W.; Kliem, H.; Meyer, H.H.D.; Ulbrich, S.E.: Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology 130 (2012) 96-104
DNS-Methylierungen am Promoter des Östrogen Rezeptors alpha (ESR1) sind als epigenetischer Mechanismus bekannt, der dessen Transkriptionshäufigkeit reguliert. Wir fragten, ob die DNS-Methylierung in Geweben männlicher heranwachsender Ferkel durch die spezifisch auftretenden Plasma Östradiol-17? (E2) Konzentrationen während der Entwicklung beeinflusst wird. Zusätzlich war es unser Ziel, das aktuell limitierte Wissen um die epigenetische Regulation des ESR1 in physiologischen Zusammenhängen zu erweitern. Drei spezifische genetische Regionen des ESR1 wurden mittels einer Kombination methylierungs-sensitiver hochauflösender Schmelzkurvenanalyse (MS-HRM) und Pyrosequencing untersucht. Erstaunlicherweise fanden wir große Unterschiede in der E2 Konzentration kaum assoziiert mit den minimalen Variation der DNS Methylierung oder der Genexpresssion. Bei der Untersuchung zweier Gewebe mit der größten Differenz an transkriptioneller Häufigkeit konnten wir aber eine einzelne CpG-Stelle in der +1kb intragenen Region des ESR1 finden, welche auffällig unterschiedlich methyliert zwischen Herz und Epididymis war. Hervorzuheben ist, dass diese einzelne CpG Stelle als eine mögliche Bindungsstelle des transkriptionellen Repressors TGIF identifiziert werden konnte, welche die Histon-Deacetylase 1 (HDAC1) rekrutieren könnte und damit zur Chromatin Kondensation führen würde. Tatsächlich konnte mittels Immunopräzipitation ein geringeres Auftreten von Histon H3 an der spezifischen ESR1 Stelle nachgewiesen werden, falls dort erhöhte DNS Methylierung vorlag. Hieraus hypothetisieren wir, dass die ESR1 Expression durch einen Methylierungsunterschied an einer einzigen CpG-Stelle bewirkt wird, welcher das Anbinden eines Trankriptionsfaktors behindert.

Leistet DNS Methylierung einen epigenetischen Beitrag zur transkriptionellen Regulation des bovinen Endometriums während des Zyklus und der frühen Trächtigkeit?
Is DNA methylation an epigenetic contribution to transcriptional regulation of the bovine Endometrium during the estrous cycle and early pregnancy?
Fürst, R.W.; Meyer, H.H.D.; Schweizer, G.12; Ulbrich, S.E.: Molecular and Cellular Endocrinology 348 (2012) 67-77
Inwieweit epigenetische Ereignisse zur transkriptionellen Regulation von Genen endometrialer Funktionen während des Zyklus und der frühen Trächtigkeit beitragen, wurde bisher kaum untersucht. Wir erforschten die Expression von DNS Methyltransferasen sowie des wichtigsten endokrinen transkriptionellen Mediators Östrogen Rezeptor Alpha (ESR1) im Endometrium von Kalbinnen an den Tagen 0, 12 und 18 des Zyklus und am Tag 18 nach der Besamung. Zur methodischen Anwendung kamen der Luminometrische Methylierungs-Assay bei der Bestimmung globaler Methylierungslevel sowie eine elegante Kombination von methylierungs-sensitiver hochauflösender Schmelzkurvenanalyse und Pyrosequencing zur Untersuchung lokaler Methylierungsgrade des ESR1. Während für ESR1 eine differentielle Genexpression zwischen den Probengruppen festgehalten werden konnte, zeigten sich keine Unterschiede in der ESR1 DNS-Methylierung der Endometrien während der einzelnen Zyklustage oder in der frühen Trächtigkeit. Auch die globale DNS-Methylierung trat in Endometrien in ähnlichen Leveln auf, vermutlich kontrolliert durch die beobachtete moderate DNMT3b Expression. Insofern erscheint der epigentische Beitrag zur endometrialen Funktion durch DNS-Methylierung eher limitiert. Da ein weiterer Gewebetyp niedrigster ESR1 Expression jedoch lokal signifikant höhere DNS-Methylierungslevel aufwies, könnte die DNS-Methylierung durchaus eine wichtige Rolle bei der gewebsspezifischen transkriptionellen Regulation spielen, welche dann durch weitere Kontrollmechanismen weiter geregelt wird.

Mütterliche Exposition gegenüber niedrigen Dosen von Östradiol-17? während der Trächtigkeit beeinflusst die nachgeburtliche Gewichtsentwicklung und Körperzusammensetzung der Nachkommen
Maternal low-dose estradiol-17? exposure during pregnancy impairs postnatal progeny weight development and body composition
Fürst, R.W.; Pistek, V.L.; Kliem, H.; Skurk, T.13,14; Hauner, H.13,14; Meyer, H.H.D.; Ulbrich, S.E.: Toxicology and Applied Pharmacology 263 (2012) 338-344
Östrogene Chemikalien mit dem Potential zur endokrinen Störung spielen eine wichtige Rolle als Auslöser von Fettleibigkeit. Untersuchungen zum potentesten natürlich vorkommenden Östrogen, dem Östradiol-17? (E2), fehlen aber bisher. Wir untersuchten deshalb endokrine und physiologische Parameter in Sauen, denen während der Trächtigkeit spezifische Mengen an E2 verabreicht wurden. Im Anschluss wurden die Nachkommen auf mögliche schädliche Einflüsse aufgrund der endokrinen Störung hin untersucht. Das E2 wurde über den gesamten Zeitraum der Trächtigkeit oral verabreicht. Die verabreichten Mengen standen stellvertretend für den täglichen Konsum von E2 im definierten Bereich des acceptable daily intake levels (ADI) (0.05µg/kg Körpergewicht/Tag), des NOEL (10µg/kg Körpergewicht/Tag) und einer hohen Dosierung (1000µg/kg Körpergewicht/Tag). Plasma Hormonkonzentrationen wurden mittels eines Enzym-Immunoassays bestimmt. Das Körperfett der Nachkommen wurde mittels Dual-Energie Röntgenabsorbtiometrie-Untersuchung erfasst. Signifikant erhöhte Plasma E2 Spiegel wurden während der gesamten Trächtigkeit in Sauen gefunden, welche 1000µg/kg Körpergewicht/Tag erhielten. Gleichzeitig wiesen diese Sauen eine erhöhte Gewichtszunahme auf. Während die Nachkommen bei der Geburt keine Gewichtsunterschiede zeigten, konnte beim Absetzten selbst bei den Ferkeln, deren Mütter lediglich 0,05 µg/kg Körpergewicht/Tag erhielten, ein signifikant geringeres Gewicht festgestellt werden. Im Alter von 8 Wochen wiesen lediglich die männlichen Tiere eine signifikante Zunahme des Körperfettanteils auf. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass eine pränatale Exposition gegenüber niedrigen Dosen von E2 die Nachkommenentwicklung in Schweinen in puncto Körpergewicht und Körperzusammensetzung beeinflusst. Ähnlich den Erfahrungen mit anderen Chemikalien, die Fettleibigkeit auslösen, deuten auch unsere Daten auf eine programmierende Wirkung des E2 während der Trächtigkeit hin, die zu den beobachteten Phänotypen führt. Aus diesem Grund könnte E2 auch einen möglichen Beitrag zur Kinder-Adipositas darstellen.

Einfluss von E. coli Lipopolysacchariden auf das Corpus luteum bei Rindern im Diöstrus
Escherichia coli lipopolysaccharide administration transiently suppresses luteal structure and function in diestrous cows
Herzog, K.15; Strüve, K.15; Kastelic, J.P.15; Piechotta, M.15; Ulbrich, S.E.; Pfarrer, C.16; Shirasuna, K.17; Shimizu, T.17; Miyamoto, A.17; Bollwein, H.18: Reproduction 144 (2012) 467-476
Es war das Ziel dieser Studie, die Effekte von intravenös verabreichtem E. coli Endotoxin (LPS) auf die Größe (LS) und Durchblutung (LBF) des Gelbkörpers, die Plasmakonzentrationen von Progesteron (P4), 13,14-dihydro-15-keto-PGF2? (PGFM) und Prostaglandin E2 (PGE) sowie die Genexpression des Gelbkörpergewebes bei Milchkühen näher zu charakterisieren. Dazu wurde Kühen an Tag 9 post ovulationem intravenös 10 ml Kochsalzlösung (0,9%) mit 0,5 µg/kg LPS intravenös verabreicht und der Gelbkörper transrektal Farbdoppler-sonographisch untersucht. Nach Injektion von LPS nahm die LS innerhalb von 24 Stunden deutlich ab (von 5,2 auf 3,8 cm²: p < 0,05) und blieb bis zum Ende des Untersuchungszeitraums kleiner als nach der Injektion von Kochsalzlösung. Der LBF verringerte sich innerhalb von drei Stunden nach Injektion der LPS-Lösung um 34% (p < 0,05) und blieb bis zum Ende des Untersuchungszeitraums niedriger als nach Injektion der Kochsalzlösung (p < 0,05). Die Plasma P4-Konzentration war während der ersten drei Stunden nach der LPS-Injektion zunächst höher (p < 0,05); neun Stunden post injectionem war P4 nach LPS-Injektion bis zum Ende des Untersuchungszeitraums niedriger als nach Verabreichung von Kochsalzlösung (p < 0,05). Die PGFM-Konzentration im Plasma stieg nach LPS-Injektion innerhalb von 30 min um das 12-fache (9.2 vs. 0.8 ng/ml; p < 0,05) und blieb über weitere 6 Stunden erhöht (p < 0,05). Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass erhöhte LPS-Konzentrationen im Diöstrus zu einer transienten Beeinflussung des Gelbkörpers führten, aber keine Auswirkung auf den Gelbkörper des folgenden Zyklus hatten. Das LPS-Modell wird derzeit bei frühträchtigen Kühen zwischen dem 33. und 38. Trächtigkeitstag mit dem Ziel angewandt, die Verbindung zwischen der temporären morphologischen und funktionellen Gelbkörper-Depression und der embryonalen Mortalität zu prüfen. Vorläufige Ergebnisse zeigen, dass trotz der Beeinträchtigung kein Fruchttod ausgelöst wird. Offensichtlich ist in diesem Stadium der Gelbkörper nicht entscheidend für das Absterben des Embryos.

Genomweite Analyse epigenetischer Mechanismen
Genomewide analysis of epigenetic mechanisms
Ulbrich, S.E.: Nova Acta Leopoldina NF 113, Nr. 388, 47-60 (2012)
Die Fähigkeit des Genoms, ausgehend von einer einzigen potenten fertilisierten Keimzelle einen multizellulären differenzierten Organismus zu steuern, stellt eine komplexe Herausforderung an die internen Regelzentren dar. Während der Zelldifferenzierung werden spezifische Netzwerke an Genen qualitativ, quantitativ, zeitlich und räumlich differenziell exprimiert, um einen spezifischen Phänotyp zu generieren. Die differenzielle Expression wird dabei auf epigenetischer Ebene durch Strukturveränderungen der DNA bzw. Chromatinmodifikationen gesteuert, die zur Genaktivierung oder zum Gensilencing führen können. Der der Steuerung zugrundeliegende Mechanismus, das Epigenom, kann als Brücke zwischen Genotyp und Phänotyp verstanden werden.
Eine Besonderheit des Epigenoms ist seine Flexibilität, die es erlaubt, ohne zugrundeliegende DNA-Modifikation auf interne und äußere Umwelteinflüsse zu reagieren. Neben Histonmodifikationen, RNA-Interferenz und Chromatin-Regulationselementen stellt die DNA-Methylierung an Cytosinbasen eine der wichtigsten epigenetischen Modifikationen dar. De- und Remethylierungen werden besonders durch exogene Einflüsse gesteuert und spielen in der Ätiologie humaner Erkrankungen als Verbindung zwischen Genetik, Erkrankung und Umwelt eine große Rolle. Epigenetische Mechanismen der Genregulation haben aber auch im Rahmen der physiologischen Anpassung eine besondere Bedeutung. Die möglichst präzise analytische Erfassung des Epigenoms ist daher Grundlage für das der phänotypischen Varianz zugrundeliegende Verständnis von Regulationsprozessen sowie der Implementierung des genetischen Kodes. In den letzten Jahren wurden bemerkenswerte Fortschritte darin erzielt, die Gesamtheit der epigenetischen Modifikationen zu erfassen. Während zunächst die Analyse von genomweitem Methylierungsgrad und spezifischer Methylierung an spezifischen CpG-Dinukleotiden und einzelnen Loci im Mittelpunkt von Methylierungsanalysen stand, hat sich im Zuge der rasant entwickelnden Möglichkeit von globalen Genom-weiten Sequenzierungen die Konstellation ergeben, dass gleichfalls quantitative holistische Methylierungsanalysen, basierend auf der Information der Vielzahl einzelner Basen, durchgeführt werden können – die Entschlüsselung des Methyloms. Verschiedene technische Methoden zur Erfassung von DNA-Methylierungsmustern und analytische Ansätze zur Erfassung der Gesamtheit von regulatorischen RNAs und komplexen Histonmodifikationen sind wegen ihrer Vor- und Nachteile bezüglich der Sensitivität, Spezifität, Quantifizierung, des Probendurchsatzes und der Kosten für spezifische Fragestellungen unterschiedlich gut geeignet.
Wegen der besonders grundlegenden Bedeutung der epigenetischen Regulationsmechanismen ist in der „post-genomischen Epoche“ die Entschlüsselung des Epigenoms eine zentrale Herausforderung, durch deren Kenntnis neue Forschungsansätze in der physiologischen und pathologischen Grundlagenforschung ermöglicht werden.

Ein Glycin-Alanin Austausch beeinflusst die Ligandenspezifität des Progestin Rezeptors des Elefanten Schwangerschaft ohne Progesteron? Eine molekulare Besonderheit des Elefanten
A single glycine-alanine exchange directs ligand specificity of the elephant progestin receptor

Wierer, M.; Schrey, A.K.19; Kühne, R.19; Ulbrich, S.E.; Meyer, H.H.D.:. Plos One 7 (2012): e50350
Elefanten haben mit 22 Monaten nicht nur die längste Tragzeit aller Landsäugetiere, sondern kontrollieren diese zudem mit einem anderen Schwangerschaftshormon als alle anderen Säugetiere. Wie verwenden sie dieses?Das Sexualhormon Progesteron erfüllt eine Schlüsselrolle in der Regulation des ovariellen Zyklus und ist verantwortlich für die Aufrechterhaltung der Schwangerschaft in den meisten Säugetierarten. Elefanten bilden die derzeit einzig bekannte Ausnahme. Anstelle von Progesteron regulieren sie ovariellen Zyklus und Schwangerschaft mit Dihydroprogesteron (DHP). Während die Progestinrezeptoren anderer Säugetierarten eine reduzierte Affinität zu DHP aufweisen, ist bekannt, dass der Elefantenrezeptor eine vergleichbare Affinität für Progesteron und DHP besitzt.Obwohl die besondere Bindungsspezifität des Elefantenrezeptors von der Gruppe um Professor Meyer am Institut für Zoo- und Wildtierforschung in Berlin bereits vor 15 Jahren entdeckt worden ist, waren deren molekulare Grundlage und ihr evolutionärer Hintergrund nach wie vor unbekannt. Das Ziel der aktuellen Studie war es daher, elefantenspezifische Mutationen im Progestinrezeptor zu identifizieren, welche dessen Spezifitätsänderung bewirken, sowie deren Kontext in der Säugetierevolution aufzuklären. Durch in vitro Bindungsstudien mit mutierten rekombinanten Ligandenbindungsdomänen des Progestinrezeptors wurde eine Glycin zu Alanin Mutation in der Sequenz des Elefantenrezeptors identifiziert, welche unabhängig von anderen Mutationen dessen veränderte Bindungsspezifität verursacht. Um die strukturelle Grundlage zu verstehen, wurden die Strukturen des humanen und des Elefantenrezeptors am Computer simuliert. Die Struktur des DHP ist im Vergleich zum Progesteron an einem Ende verdreht. Im humanen Rezeptor nimmt sie dadurch eine nichtoptimale Position in dessen Ligandenbindungstasche ein. Die längere Seitenkette des Alanins im Elefantenrezeptor drängt DHP dagegen in eine ähnliche Position wie Progesteron, was die vergleichbare Affinität für beide Liganden bedingt.Die Evolution der Spezifität von Steroidrezeptoren ist nach wie vor unvollständig untersucht. Die Studie ist die erste vergleichende Studie der Progestinrezeptorspezifität auf molekularer Ebene innerhalb der Evolution von Säugetieren. Neben dem Elefanten wurde die Mutation auch in Pferden entdeckt, von denen bekannt ist, dass sie in späteren Schwangerschaftsabschnitten ebenfalls DHP zur Aufrechterhaltung der Schwangerschaft verwenden. Überraschenderweise war die Mutation auch in drei weiteren Säugetierordnungen vorhanden. Da diese Form der parallelen Evolution extrem selten ist, wird eine besondere Bedeutung dieser Position in der Entwicklung unterschiedlicher Schwangerschaftshormonsysteme vorgeschlagen.Die Entwicklung spezifischer Liganden oder Inhibitoren von Steroidrezeptoren ist von großer klinischer Bedeutung. Eine genaue Kenntnis der Ligandenbindungstasche und deren intramolekularen Wechselwirkungen ist Voraussetzung für das Design solcher chemischen Verbindungen. Die Studie liefert einen Beitrag zum Verständnis der Bedeutung einzelner Aminosäuren der Ligandenbindungsdomäne auf die Affinität von endogenen und synthetischen Liganden.

Forschung 2012

II.    Reproduktionsbiologie

Vergleich der Effekte der Frühträchtigkeit mit humanem Interferon alpha 2 (IFNA2) auf die Genexpression im bovinen Endometrium
Comparison of the effects of early pregnancy with human interferon, alpha 2 (IFNA2), on gene expression in bovine Endometrium
Bauersachs, S.4,5,6; Ulbrich, S.E.; Reichenbach, H.-D.7; Reichenbach, M.5,8; Büttner, M.9; Meyer, H.H.D.; Spencer, T.E.10; Minten, M.10; Sax, G.11; Winter, G.11; Wolf, E.5,6: Biology of Reproduction 86 (2012) 1-15
Interferon tau (IFNT), ein Typ I IFN, welches dem IFN alpha (IFNA) ähnlich ist, wird vom bovinen Embryo sezerniert und übernimmt die Funktion der Trächtigkeitserkennung beim Wiederkäuer. Um spezifische Effekte von IFNT gegenüber weiteren embryonalen Signalen zu untersuchen, wurden in dieser Studie die Änderungen der Transkription der Uterusschleimhaut während der frühen Trächtigkeit verglichen mit dem Transkriptom nach intrauteriner Applikation von humanem IFNA2. Die Analyse erfolgte mittels cDNA Hybridisierungsarrays (Affymetrix Bovine Genome Array). Durch den Vergleich der beiden Datensätze konnten solche Gene identifiziert werden, deren Abundanz nur in Anwesenheit vom Embryo bzw. nur in Anwesenheit von IFNA2 verändert waren. Dies deutet darauf hin, dass IFN im Zusammenhang mit der Frühträchtigkeit eine wesentliche Rolle spielt, dass aber der Embryo eine Reihe weiterer spezifischer Signale aussendet, die auf die Funktion der Gebärmutterschleimhaut einen Einfluss haben.

Eine einzelne differentiell methylierte CpG-Stelle korreliert mit der Transkription des Östrogen Rezeptors alpha
A differentially methylated single CpG-site is correlated with estrogen receptor alpha transcription
Fürst, R.W.; Kliem, H.; Meyer, H.H.D.; Ulbrich, S.E.:
Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology 130 (2012) 96-104
DNS-Methylierungen am Promoter des Östrogen Rezeptors alpha (ESR1) sind als epigenetischer Mechanismus bekannt, der dessen Transkriptionshäufigkeit reguliert. Wir fragten, ob die DNS-Methylierung in Geweben männlicher heranwachsender Ferkel durch die spezifisch auftretenden Plasma Östradiol-17? (E2) Konzentrationen während der Entwicklung beeinflusst wird. Zusätzlich war es unser Ziel, das aktuell limitierte Wissen um die epigenetische Regulation des ESR1 in physiologischen Zusammenhängen zu erweitern. Drei spezifische genetische Regionen des ESR1 wurden mittels einer Kombination methylierungs-sensitiver hochauflösender Schmelzkurvenanalyse (MS-HRM) und Pyrosequencing untersucht. Erstaunlicherweise fanden wir große Unterschiede in der E2 Konzentration kaum assoziiert mit den minimalen Variation der DNS Methylierung oder der Genexpresssion. Bei der Untersuchung zweier Gewebe mit der größten Differenz an transkriptioneller Häufigkeit konnten wir aber eine einzelne CpG-Stelle in der +1kb intragenen Region des ESR1 finden, welche auffällig unterschiedlich methyliert zwischen Herz und Epididymis war. Hervorzuheben ist, dass diese einzelne CpG Stelle als eine mögliche Bindungsstelle des transkriptionellen Repressors TGIF identifiziert werden konnte, welche die Histon-Deacetylase 1 (HDAC1) rekrutieren könnte und damit zur Chromatin Kondensation führen würde. Tatsächlich konnte mittels Immunopräzipitation ein geringeres Auftreten von Histon H3 an der spezifischen ESR1 Stelle nachgewiesen werden, falls dort erhöhte DNS Methylierung vorlag. Hieraus hypothetisieren wir, dass die ESR1 Expression durch einen Methylierungsunterschied an einer einzigen CpG-Stelle bewirkt wird, welcher das Anbinden eines Trankriptionsfaktors behindert.

Leistet DNS Methylierung einen epigenetischen Beitrag zur transkriptionellen Regulation des bovinen Endometriums während des Zyklus und der frühen Trächtigkeit?
Is DNA methylation an epigenetic contribution to transcriptional regulation of the bovine Endometrium during the estrous cycle and early pregnancy?
Fürst, R.W.; Meyer, H.H.D.; Schweizer, G.12; Ulbrich, S.E.: Molecular and Cellular Endocrinology 348 (2012) 67-77
Inwieweit epigenetische Ereignisse zur transkriptionellen Regulation von Genen endometrialer Funktionen während des Zyklus und der frühen Trächtigkeit beitragen, wurde bisher kaum untersucht. Wir erforschten die Expression von DNS Methyltransferasen sowie des wichtigsten endokrinen transkriptionellen Mediators Östrogen Rezeptor Alpha (ESR1) im Endometrium von Kalbinnen an den Tagen 0, 12 und 18 des Zyklus und am Tag 18 nach der Besamung. Zur methodischen Anwendung kamen der Luminometrische Methylierungs-Assay bei der Bestimmung globaler Methylierungslevel sowie eine elegante Kombination von methylierungs-sensitiver hochauflösender Schmelzkurvenanalyse und Pyrosequencing zur Untersuchung lokaler Methylierungsgrade des ESR1. Während für ESR1 eine differentielle Genexpression zwischen den Probengruppen festgehalten werden konnte, zeigten sich keine Unterschiede in der ESR1 DNS-Methylierung der Endometrien während der einzelnen Zyklustage oder in der frühen Trächtigkeit. Auch die globale DNS-Methylierung trat in Endometrien in ähnlichen Leveln auf, vermutlich kontrolliert durch die beobachtete moderate DNMT3b Expression. Insofern erscheint der epigentische Beitrag zur endometrialen Funktion durch DNS-Methylierung eher limitiert. Da ein weiterer Gewebetyp niedrigster ESR1 Expression jedoch lokal signifikant höhere DNS-Methylierungslevel aufwies, könnte die DNS-Methylierung durchaus eine wichtige Rolle bei der gewebsspezifischen transkriptionellen Regulation spielen, welche dann durch weitere Kontrollmechanismen weiter geregelt wird.

Mütterliche Exposition gegenüber niedrigen Dosen von Östradiol-17? während der Trächtigkeit beeinflusst die nachgeburtliche Gewichtsentwicklung und Körperzusammensetzung der Nachkommen
Maternal low-dose estradiol-17? exposure during pregnancy impairs postnatal progeny weight development and body composition
Fürst, R.W.; Pistek, V.L.; Kliem, H.; Skurk, T.13,14; Hauner, H.13,14; Meyer, H.H.D.; Ulbrich, S.E.: Toxicology and Applied Pharmacology 263 (2012) 338-344
Östrogene Chemikalien mit dem Potential zur endokrinen Störung spielen eine wichtige Rolle als Auslöser von Fettleibigkeit. Untersuchungen zum potentesten natürlich vorkommenden Östrogen, dem Östradiol-17? (E2), fehlen aber bisher. Wir untersuchten deshalb endokrine und physiologische Parameter in Sauen, denen während der Trächtigkeit spezifische Mengen an E2 verabreicht wurden. Im Anschluss wurden die Nachkommen auf mögliche schädliche Einflüsse aufgrund der endokrinen Störung hin untersucht. Das E2 wurde über den gesamten Zeitraum der Trächtigkeit oral verabreicht. Die verabreichten Mengen standen stellvertretend für den täglichen Konsum von E2 im definierten Bereich des acceptable daily intake levels (ADI) (0.05µg/kg Körpergewicht/Tag), des NOEL (10µg/kg Körpergewicht/Tag) und einer hohen Dosierung (1000µg/kg Körpergewicht/Tag). Plasma Hormonkonzentrationen wurden mittels eines Enzym-Immunoassays bestimmt. Das Körperfett der Nachkommen wurde mittels Dual-Energie Röntgenabsorbtiometrie-Untersuchung erfasst. Signifikant erhöhte Plasma E2 Spiegel wurden während der gesamten Trächtigkeit in Sauen gefunden, welche 1000µg/kg Körpergewicht/Tag erhielten. Gleichzeitig wiesen diese Sauen eine erhöhte Gewichtszunahme auf. Während die Nachkommen bei der Geburt keine Gewichtsunterschiede zeigten, konnte beim Absetzten selbst bei den Ferkeln, deren Mütter lediglich 0,05 µg/kg Körpergewicht/Tag erhielten, ein signifikant geringeres Gewicht festgestellt werden. Im Alter von 8 Wochen wiesen lediglich die männlichen Tiere eine signifikante Zunahme des Körperfettanteils auf. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass eine pränatale Exposition gegenüber niedrigen Dosen von E2 die Nachkommenentwicklung in Schweinen in puncto Körpergewicht und Körperzusammensetzung beeinflusst. Ähnlich den Erfahrungen mit anderen Chemikalien, die Fettleibigkeit auslösen, deuten auch unsere Daten auf eine programmierende Wirkung des E2 während der Trächtigkeit hin, die zu den beobachteten Phänotypen führt. Aus diesem Grund könnte E2 auch einen möglichen Beitrag zur Kinder-Adipositas darstellen.

Einfluss von E. coli Lipopolysacchariden auf das Corpus luteum bei Rindern im Diöstrus
Escherichia coli lipopolysaccharide administration transiently suppresses luteal structure and function in diestrous cows
Herzog, K.15; Strüve, K.15; Kastelic, J.P.15; Piechotta, M.15; Ulbrich, S.E.; Pfarrer, C.16; Shirasuna, K.17; Shimizu, T.17; Miyamoto, A.17; Bollwein, H.18: Reproduction 144 (2012) 467-476
Es war das Ziel dieser Studie, die Effekte von intravenös verabreichtem E. coli Endotoxin (LPS) auf die Größe (LS) und Durchblutung (LBF) des Gelbkörpers, die Plasmakonzentrationen von Progesteron (P4), 13,14-dihydro-15-keto-PGF2? (PGFM) und Prostaglandin E2 (PGE) sowie die Genexpression des Gelbkörpergewebes bei Milchkühen näher zu charakterisieren. Dazu wurde Kühen an Tag 9 post ovulationem intravenös 10 ml Kochsalzlösung (0,9%) mit 0,5 µg/kg LPS intravenös verabreicht und der Gelbkörper transrektal Farbdoppler-sonographisch untersucht. Nach Injektion von LPS nahm die LS innerhalb von 24 Stunden deutlich ab (von 5,2 auf 3,8 cm²: p < 0,05) und blieb bis zum Ende des Untersuchungszeitraums kleiner als nach der Injektion von Kochsalzlösung. Der LBF verringerte sich innerhalb von drei Stunden nach Injektion der LPS-Lösung um 34% (p < 0,05) und blieb bis zum Ende des Untersuchungszeitraums niedriger als nach Injektion der Kochsalzlösung (p < 0,05). Die Plasma P4-Konzentration war während der ersten drei Stunden nach der LPS-Injektion zunächst höher (p < 0,05); neun Stunden post injectionem war P4 nach LPS-Injektion bis zum Ende des Untersuchungszeitraums niedriger als nach Verabreichung von Kochsalzlösung (p < 0,05). Die PGFM-Konzentration im Plasma stieg nach LPS-Injektion innerhalb von 30 min um das 12-fache (9.2 vs. 0.8 ng/ml; p < 0,05) und blieb über weitere 6 Stunden erhöht (p < 0,05). Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass erhöhte LPS-Konzentrationen im Diöstrus zu einer transienten Beeinflussung des Gelbkörpers führten, aber keine Auswirkung auf den Gelbkörper des folgenden Zyklus hatten. Das LPS-Modell wird derzeit bei frühträchtigen Kühen zwischen dem 33. und 38. Trächtigkeitstag mit dem Ziel angewandt, die Verbindung zwischen der temporären morphologischen und funktionellen Gelbkörper-Depression und der embryonalen Mortalität zu prüfen. Vorläufige Ergebnisse zeigen, dass trotz der Beeinträchtigung kein Fruchttod ausgelöst wird. Offensichtlich ist in diesem Stadium der Gelbkörper nicht entscheidend für das Absterben des Embryos.

Genomweite Analyse epigenetischer Mechanismen
Genomewide analysis of epigenetic mechanisms
Ulbrich, S.E.: Nova Acta Leopoldina NF 113, Nr. 388, 47-60 (2012)
Die Fähigkeit des Genoms, ausgehend von einer einzigen potenten fertilisierten Keimzelle einen multizellulären differenzierten Organismus zu steuern, stellt eine komplexe Herausforderung an die internen Regelzentren dar. Während der Zelldifferenzierung werden spezifische Netzwerke an Genen qualitativ, quantitativ, zeitlich und räumlich differenziell exprimiert, um einen spezifischen Phänotyp zu generieren. Die differenzielle Expression wird dabei auf epigenetischer Ebene durch Strukturveränderungen der DNA bzw. Chromatinmodifikationen gesteuert, die zur Genaktivierung oder zum Gensilencing führen können. Der der Steuerung zugrundeliegende Mechanismus, das Epigenom, kann als Brücke zwischen Genotyp und Phänotyp verstanden werden. Eine Besonderheit des Epigenoms ist seine Flexibilität, die es erlaubt, ohne zugrundeliegende DNA-Modifikation auf interne und äußere Umwelteinflüsse zu reagieren. Neben Histonmodifikationen, RNA-Interferenz und Chromatin-Regulationselementen stellt die DNA-Methylierung an Cytosinbasen eine der wichtigsten epigenetischen Modifikationen dar. De- und Remethylierungen werden besonders durch exogene Einflüsse gesteuert und spielen in der Ätiologie humaner Erkrankungen als Verbindung zwischen Genetik, Erkrankung und Umwelt eine große Rolle. Epigenetische Mechanismen der Genregulation haben aber auch im Rahmen der physiologischen Anpassung eine besondere Bedeutung. Die möglichst präzise analytische Erfassung des Epigenoms ist daher Grundlage für das der phänotypischen Varianz zugrundeliegende Verständnis von Regulationsprozessen sowie der Implementierung des genetischen Kodes. In den letzten Jahren wurden bemerkenswerte Fortschritte darin erzielt, die Gesamtheit der epigenetischen Modifikationen zu erfassen. Während zunächst die Analyse von genomweitem Methylierungsgrad und spezifischer Methylierung an spezifischen CpG-Dinukleotiden und einzelnen Loci im Mittelpunkt von Methylierungsanalysen stand, hat sich im Zuge der rasant entwickelnden Möglichkeit von globalen Genom-weiten Sequenzierungen die Konstellation ergeben, dass gleichfalls quantitative holistische Methylierungsanalysen, basierend auf der Information der Vielzahl einzelner Basen, durchgeführt werden können – die Entschlüsselung des Methyloms. Verschiedene technische Methoden zur Erfassung von DNA-Methylierungsmustern und analytische Ansätze zur Erfassung der Gesamtheit von regulatorischen RNAs und komplexen Histonmodifikationen sind wegen ihrer Vor- und Nachteile bezüglich der Sensitivität, Spezifität, Quantifizierung, des Probendurchsatzes und der Kosten für spezifische Fragestellungen unterschiedlich gut geeignet. Wegen der besonders grundlegenden Bedeutung der epigenetischen Regulationsmechanismen ist in der „post-genomischen Epoche“ die Entschlüsselung des Epigenoms eine zentrale Herausforderung, durch deren Kenntnis neue Forschungsansätze in der physiologischen und pathologischen Grundlagenforschung ermöglicht werden.

Ein Glycin-Alanin Austausch beeinflusst die Ligandenspezifität des Progestin Rezeptors des Elefanten Schwangerschaft ohne Progesteron? Eine molekulare Besonderheit des Elefanten
A single glycine-alanine exchange directs ligand specificity of the elephant progestin receptor
Wierer, M.; Schrey, A.K.19; Kühne, R.19; Ulbrich, S.E.; Meyer, H.H.D.:. Plos One 7 (2012): e50350
Elefanten haben mit 22 Monaten nicht nur die längste Tragzeit aller Landsäugetiere, sondern kontrollieren diese zudem mit einem anderen Schwangerschaftshormon als alle anderen Säugetiere. Wie verwenden sie dieses? Das Sexualhormon Progesteron erfüllt eine Schlüsselrolle in der Regulation des ovariellen Zyklus und ist verantwortlich für die Aufrechterhaltung der Schwangerschaft in den meisten Säugetierarten. Elefanten bilden die derzeit einzig bekannte Ausnahme. Anstelle von Progesteron regulieren sie ovariellen Zyklus und Schwangerschaft mit Dihydroprogesteron (DHP). Während die Progestinrezeptoren anderer Säugetierarten eine reduzierte Affinität zu DHP aufweisen, ist bekannt, dass der Elefantenrezeptor eine vergleichbare Affinität für Progesteron und DHP besitzt.
Obwohl die besondere Bindungsspezifität des Elefantenrezeptors von der Gruppe um Professor Meyer am Institut für Zoo- und Wildtierforschung in Berlin bereits vor 15 Jahren entdeckt worden ist, waren deren molekulare Grundlage und ihr evolutionärer Hintergrund nach wie vor unbekannt. Das Ziel der aktuellen Studie war es daher, elefantenspezifische Mutationen im Progestinrezeptor zu identifizieren, welche dessen Spezifitätsänderung bewirken, sowie deren Kontext in der Säugetierevolution aufzuklären.
Durch in vitro Bindungsstudien mit mutierten rekombinanten Ligandenbindungsdomänen des Progestinrezeptors wurde eine Glycin zu Alanin Mutation in der Sequenz des Elefantenrezeptors identifiziert, welche unabhängig von anderen Mutationen dessen veränderte Bindungsspezifität verursacht. Um die strukturelle Grundlage zu verstehen, wurden die Strukturen des humanen und des Elefantenrezeptors am Computer simuliert. Die Struktur des DHP ist im Vergleich zum Progesteron an einem Ende verdreht. Im humanen Rezeptor nimmt sie dadurch eine nichtoptimale Position in dessen Ligandenbindungstasche ein. Die längere Seitenkette des Alanins im Elefantenrezeptor drängt DHP dagegen in eine ähnliche Position wie Progesteron, was die vergleichbare Affinität für beide Liganden bedingt.
Die Evolution der Spezifität von Steroidrezeptoren ist nach wie vor unvollständig untersucht. Die Studie ist die erste vergleichende Studie der Progestinrezeptorspezifität auf molekularer Ebene innerhalb der Evolution von Säugetieren. Neben dem Elefanten wurde die Mutation auch in Pferden entdeckt, von denen bekannt ist, dass sie in späteren Schwangerschaftsabschnitten ebenfalls DHP zur Aufrechterhaltung der Schwangerschaft verwenden. Überraschenderweise war die Mutation auch in drei weiteren Säugetierordnungen vorhanden. Da diese Form der parallelen Evolution extrem selten ist, wird eine besondere Bedeutung dieser Position in der Entwicklung unterschiedlicher Schwangerschaftshormonsysteme vorgeschlagen.
Die Entwicklung spezifischer Liganden oder Inhibitoren von Steroidrezeptoren ist von großer klinischer Bedeutung. Eine genaue Kenntnis der Ligandenbindungstasche und deren intramolekularen Wechselwirkungen ist Voraussetzung für das Design solcher chemischen Verbindungen. Die Studie liefert einen Beitrag zum Verständnis der Bedeutung einzelner Aminosäuren der Ligandenbindungsdomäne auf die Affinität von endogenen und synthetischen Liganden.

Forschung 2012

III. Lebensmittelsicherheit, Ernährung und Umwelt

Nachweis des insektiziden Cry1Ab Proteins in Bodenproben aus den letzten Anbaujahren eines 9-jährigen Feldversuchs mit Bt-Mais (MON810).Determination of insecticidal Cry1Ab protein in soil collected in the final growing seasons of a nine-year field trial of Bt-maize MON810.Gruber, H.20; Paul, V.21; Meyer, H.H.D.; Müller, M.20: Transgenic Research 21 (2012) 77-88Beim Anbau von gentechnisch verändertem Mais (Bt-Mais, Event MON810), der in seinen Pflanzenteilen das rekombinante ?-Endotoxin Cry1Ab produziert, wird das insektizide Protein über Wurzelexsudate und Ernterückstände in den Boden eingetragen. In der vorliegenden Studie wurde der potentielle Verbleib von Cry1Ab im Boden unter Langzeitanbau von Bt-Mais untersucht. Dies erfolgte anhand eines über neun Jahre andauernden Feldversuchs auf vier süddeutschen Versuchsflächen, die mit MON810 Mais und einer nah isogenen Nicht-Bt-Maissorte bestellt wurden. Cry1Ab Protein wurde mittels eines in–house validierten ELISA im Boden (< 2 mm Korngrösse) quantifiziert. Der Assay ermöglicht den Nachweis und die Quantifizierung von Cry1Ab mit einer Entscheidungsgrenze (CC?) von 2,0 ng Cry1Ab Protein g-1 Boden. Die analytischen Wiederfindungsraten liegen im Bereich von 49,1 bis zu 88,9 % und korrelieren deutlich mit den Tongehalten der Böden. Cry1Ab Protein wurde nur auf einer Versuchsfläche in Konzentrationen oberhalb CC? nachgewiesen. Auf der Fläche wurde in Proben, die sechs Wochen nach der Ernte gezogen worden waren, 2,91 ng und 2,57 ng Cry1Ab Protein g-1 Boden im Ober- und Unterboden quantifiziert. In Bodenproben vom Frühjahr vor dem nächsten Maisanbau wurde auf keinem der vier Versuchsstandorte Cry1Ab Protein nachgewiesen. Die Ergebnisse weisen auf einen schnellen und effizienten Abbau des Cry1Ab Proteins aus Wurzelexsudaten und Bt-Mais Ernteresten in Boden hin. In der gesamten Feldstudie zeigten sich keine Hinweise auf eine Akkumulation oder Überdauerung des Cry1Ab Protein in verschiedenen Böden unter Langzeitanbau von Bt-Mais.

Fütterung von gentechnisch verändertem Mais (MON810) an Milchkühe – Vergleich der Genexpressionsmuster von Markern für Apoptose, Entzündungsgeschehen und Zellzyklus.
Feeding genetically modified maize (MON810) to dairy cows: comparison of gene expression pattern of markers for apoptosis, inflammation and cell cycle.
Gürtler, P.22; Brandl, C.; Meyer, H.H.D.; Tichopad, A.: J Verbr Lebensm 7 (2012) 195-202
Der Einsatz von gentechnisch verändertem Mais MON810 in der Tierfütterung und zur menschlichen Ernährung hat in der Bevölkerung Bedenken ausgelöst. Viele wissenschaftliche Studien haben sich bereits mit den potentiellen Effekten einer Fütterung von MON810 auf die Leistung und die Tiergesundheit von Nutztieren, sowie mit dem Verbleib der rekombinanten DNA und des Proteins beschäftigt. Allerdings gibt es bisher keine Informationen über Effekte einer Fütterung von gentechnisch verändertem Mais auf der Ebene der Genexpression.
Von 2005 bis 2007 wurde eine Studie mit 36 laktierenden Milchkühen durchgeführt, von denen eine Gruppe mit gentechnisch verändertem Mais (MON810) und die andere Gruppe mit nicht gentechnisch verändertem Mais gefüttert wurde, um den Verbleib der rekombinanten DNA und des Proteins zu untersuchen. Nach 25 Monaten wurden zehn Kühe der mit transgenem Mais gefütterten Gruppe und sieben Kühe der mit nicht gentechnisch verändertem Mais gefütterten Gruppe geschlachtet. Gewebeproben des Gastrointestinaltrakts und der Leber wurden entnommen und für die Analyse der Genexpression zentraler Gene des Entzündungsgeschehens, des Zellzyklus und der Apoptose verwendet.
Die statistische Analyse der Ergebnisse ergab keine signifikanten Unterschiede im Genexpressionsmuster der beiden Gruppen. Dies deutet darauf hin, dass die Fütterung von gentechnisch verändertem Mais MON810 keinen Einfluss auf die Apoptose, das Entzündungsgeschehen und den Zellzyklus im Gastrointestinaltrakt oder der Leber von Milchkühen hat.

Zucht auf die Produktionsmerkmale – Lebensmittelbiogenese in einer sich ändernden Welt.
Bredding for production traits - Food biogenesis in a changing world.
Meyer, H.H.D.: Nova Acta Leopoldina NF 113, Nr. 388, 243-258 (2012)
In der Fleischproduktion ist die Tierzucht den Vorgaben des Verbrauchers bereits vor Jahrzehnten gefolgt, und die Tierkörper moderner Rassen enthalten deutlich weniger Fett. Demgegenüber ist die Milchzusammensetzung nahezu unverändert geblieben, und eine klare Marktorientierung bzw. ein Paradigmenwechsel ist überfällig. Die Analyse des gesamten Produktionsnetzwerkes in Hinblick auf weitere Möglichkeiten der Optimierung erlaubt nicht nur die Anpassung an die Bedürfnisse der Verbraucher, sondern ist auch der effizienteste Weg zur Umweltentlastung. Die enge Kooperation aller Disziplinen von der Tier- und Pflanzenzucht bis zur Technologie und Ökonomie ist dazu unerlässlich. Die Herausforderungen der Zukunft erfordern es, den Fortschritt des Wissens verantwortungsvoll in Diagnostik und Tierzucht zu nutzen. Die allseitige Verfügbarmachung leistungsfähiger Technologien ist dabei ein vordringliches Anliegen.

Untersuchung der Verstoffwechselung von 1,8-Cineol in einem intestinalen Zellkulturmodell und Erfassung seiner immunomodulatorischen Effekte via Genexpressionsanalyse.
Investigation into the metabolism of 1,8-cineole in an intestinal cell culture model and acquisition of its immune-modulatory effect via gene expression analysis.
Müller, J.; Gruner, N.23; Almstätter, I.; Kirsch, F.23; Buettner, A.23,24; Pfaffl, M.W.: Flavour Fragr J 27 (2012) 405-413
1,8-Cineol, ein weit verbreiteter und angewendeter volatiler Stoff mit antiphlogistischen und antiinflammatorischen Eigenschaften, wurde hinsichtlich seines physiologischen Impacts untersucht, im Wesentlichen bezogen auf den intestinalen Bereich. Das Ziel der Studie war es, durch ein multi-methodisches Setting sowohl potentielle Biotransformationen von Chemo-Analyten sowie physiologische und immunologische Einflüsse zu erfassen, um weitergreifende Effekte im Zuge eines vermittelten Biofeedbacks zu untersuchen. Reverse transkriptase quantitative Echtzeit Polymerase Kettenreaktion (RTqPCR) diente zur Erfassung von Änderungen der Genexpression von einschlägigen Marker Genen nach 1,8-Cineol Behandlung. Einflüsse von 1,8-Cineol auf die Zellteilung und Fitness von intestinalen Zellen wurden mittels Elektrischer Zell-Substrat Impedanz Messung (ECIS) erfasst. Unsere Studien zeigten, dass die 1,8-Cineol Gabe weder zu nennenswerten Veränderungen des Genexpressionsmusters führte, noch konnte Verstoffwechslung durch das zugrundeliegende Zellkulturmodell nachgewiesen werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass das verabreichte 1,8-Cineol weder in physiologischen noch in pharmakologischen Dosen Einfluss auf Entwicklung oder den Zustand des intestinalen Epithels hatte und dies weder während der Zellteilungsphase noch auf einen geschlossenen Zellrasen. Lediglich auf die Gabe hoher 1,8-Cineol Konzentrationen (> 1g/l) reagierte das Modell mit massivem Ablösen des Zellrasens. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass auch gebräuchliche und hohe Dosen von 1,8-Cineol nicht zu nennenswerten physiologischen Reaktionen führen bis hin zu einer kritischen Konzentration, welche zum Absterben der Zellen führt.

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IV. Wachstumsphysiologie, myotrope Therapeutika und Anabolika

Der physiologische Weg: Überwachung von Veränderungen in der RNA Expression als neue Herangehensweise im Kampf gegen die illegale Applikation von Wachstumsförderern.
The physiological way: Monitoring RNA expression changes as new approach to combat illegal growth promoter application.
Riedmaier, I.; Pfaffl, M.W.; Meyer, H.H.D.: Drug Testing and Analysis 4 (2012) 70–74
Der Gebrauch wachstumsfördernder Substanzen in lebensmittelproduzierenden Tieren ist innerhalb der EU verboten. Deshalb wurde ein striktes Kontrollprogramm entwickelt, innerhalb dessen alle bekannten Wachstumsförderer mittels Chromatographie kombiniert mit Massenspektrometrie oder mit Immunoassays detektiert werden. Neue xenobiotische Substanzen oder Hormoncocktails sind mit diesen Methoden nicht nachweisbar, weshalb die Entwicklung neuer sensitiver Methoden sehr wichtig ist.
Eine vielversprechende indirekte Herangehensweise ist der Nachweis physiologischer Effekte der verabreichten Wachstumsförderer auf molekularer Ebene mit der Hilfe von "Omic" Technologien. Die Analyse des Transkriptoms auf der Ebene der mRNA und der miRNA zur Detektion von Biomarkern ist eine mögliche Strategie, um neue Screeningmethoden zu entwickeln. In diesem Artikel werden alle verfügbaren Technologien zur  Analyse von Genexpressionen zusammengefasst und die bisherigen Erfolge in der Analyse des Transkriptoms zur Identifizierung potentieller Genexpressionsbiomarker für den Missbrauch anaboler Substanzen in Rindern beschrieben.

RNA-Sequencing als Screening-Methode im Kampf gegen den Missbrauch anaboler Substanzen.
RNA-Sequencing as useful screening tool in the combat against the misuse of anabolic agents.
Riedmaier, I.; Benes, V.25; Blake, J.25; Bretschneider, N.26; Zinser, C.26; Becker, C.1; Meyer, H.H.D.; Pfaffl, M.W.: Anal Chem 84 (2012) 6863-6868
Der Missbrauch anaboler Substanzen in der Tiermast ist innerhalb der EU verboten und gut kontrolliert. Die Anwendung neuer, unbekannter Substanzen oder von Substanzcocktails stellt ein großes Problem für die angewendeten Screeningmethoden dar, weswegen die Entwicklung neuer Screeningmethoden in diesem Bereich sehr wichtig ist. Die Analyse physiologischer Veränderungen auf molekularer Ebene, zum Beispiel auf der Ebene der Genexpression, verursacht durch die Gabe anaboler Substanzen, ist hierbei eine neue Herangehensweise. Eine neue Methode für die ganzheitliche Analyse des Transkriptoms stellt das RNA-Sequencing dar. In dieser Studie wurde das Potenzial dieser Methode in der Biomarkerforschung getestet.
Mittels RNA-Sequencing konnten 20 neue Biomarker-Kandidaten  für den Missbrauch von Trenbolon Azetat plus Estradiol in der bovinen Leber gefunden werden. Mit Hilfe von biostatistischen Methoden zur Clusterbildung konnten behandelte Tiere von unbehandelten Tieren separiert werden. Es war außerdem möglich, diese Kandidatengene in Ebern und Kälbern, welche mit anabolen Substanzen behandelt wurden, zu bestätigen. Diese Ergebnisse zeigen das Potential der RNA-Sequencing Methode, um Biomarker Kandidaten für den Nachweis des Missbrauchs anaboler Substanzen zu detektieren.

Forschung 2012

V.  Bioanalytik

Starke Effekte der Profiling Platform und Normalisierungsstrategie auf die Detektion von differentiell exprimierten microRNAs – Eine vergleichende Studie.
Profound effect of profiling platform and normalization strategy on detection of differentially expressed micro RNAs – a comparative study.
Meyer, S.U.; Kaiser, S.27; Wagner, C.28; Thirion, C.29; Pfaffl, M.W.: Plos One 7 (2012): e38946
Eine angemessene Normalisierung minimiert den Effekt systematischer technischer Variation und ist eine Voraussetzung, um aussagekräftige biologische Unterschiede zu erhalten. Jedoch besteht keine Einheitlichkeit bezüglich der Leistungen und Empfehlungen der miRNA-Normalisierung. Aus diesem Grund untersuchten wir den Einfluss von sieben unterschiedlichen Normalisierungsmethoden (Reference Gene Index, Global Geometric Mean, Quantile, Invariant Selection, Loess, LoessM, und Generalized Procrustes Analysis) auf die Intra- und Interplattformleistung von zwei unterschiedlichen gebräuchlichen miRNA-Profilingplattformen.
Wir verwendeten Daten von miRNA-Profilinganalysen, die von einer hybridisierungsbasierten Plattform (Agilent Technologies) und einer RT-qPCR Plattform (Applied Biosystems) stammen. Weiterhin validierten wir eine Untergruppe von miRNAs mit individuellen qPCR-Assays. Unsere Analyse schließt Daten von dem Differenzierungseffekt und dem Einfluss einer Behandlung mit Tumor Necrosis Factor alpha auf primäre humane Skelettmuskelzellen und einer murinen Skelettmuskelzelllinie mit ein. Unterschiedliche Normalisierungsmethoden haben einen unterschiedlichen Einfluss auf (i) Standardabweichungen, (ii) Fläche unter der Receiver Operating Characteristic (ROC) Kurve und (iii) Ähnlichkeit der differentiellen Expression. Loess, LoessM, und Quantile Analysen waren am effizientesten bei der Minimierung der Standardabweichungen auf der Agilent und TLDA Platform. Zudem vergrößerten Loess, LoessM, Invariant Selection und die Generalized Procrustes Analyse die Fläche unter der ROC Kurve, ein Maß für die statistische Güte eines Tests. Der Jaccard Index zeigte, dass die Interplatformübereinstimmung der differentiellen Expression durch Loess, LoessM, Quantile, und GPA Normalisierung der AGL und TLDA Daten sowie RGI Normalisierung der TLDA Daten tendenziell vergrößert wurden.
Wir empfehlen die Anwendung der Loess oder LoessM und GPA Normalisierung für miRNA Agilent Arrays und qPCR Karten, weil diese Normalisierungsmethoden folgendes zeigten: (i) effektive Verminderung der Standardabweichungen, (ii) Erhöhung der Sensitivität und Genauigkeit der Detektion von differentieller miRNA Expression sowie (iii) Erhöhung der Interplatformübereinstimmung. Die Ergebnisse zeigen die erfolgreiche Übertragung der LoessM und Generalized Procrustes Analysis auf einfarbige miRNA Profiling Experimente.

 

RNA Interference Off Target Screening mittels Principal component Analysis.
RNA Interference Off-target Screening using principal component analysis.
Müller, J.; Pfaffl; M.W.: J Data Mining Genomics Proteomics 2012, 3:2
Off-target Effekte stellen nach wie vor die größte Problematik in RNAi-knockdown Anwendungen dar. Während wir Zellkultur Funktionsverlustanalysen evaluierten durch Heat Map und Principal Component Analyse (PCA) durchführten, fiel uns auf, dass die PCA hervorragend dazu geeignet ist, off-target Effekte aufzuzeigen. Aufgrund der Unkenntnis von off-target Effekten in unseren Zellkulturexperimenten designten wir ein in silico Datenmodell, um zu demonstrieren, wie die PCA dazu genutzt werden kann, off-target Effekte zu filtern. Mit Hilfe des hier präsentierten Datenmodells ist es möglich, Effekte verschiedener Einflussfaktoren auf Genexpressionsmuster zu simulieren. Beabsichtigte Effekte durch Gen-Knockdown oder Behandlungen mit aktiven Substanzen können klar von begleitenden off-target Effekten getrennt werden. Mittels mehrerer randomisierter Genexpressions-Datensets können wir zeigen, dass die PCA im Vergleich zur Heat Map effektiver off-target Effekte von Target Effekten trennen kann.

 

Auswirkungen magnetischer Stimulation auf das Gen-Expressions-Profil in vitro kultivierter, neuronaler Zellen.
Effect of magnetic stimulation on the gene expression profile of in vitro cultured neural cells.
Stock, M.30; Kirchner, B.; Waibler, D.31; Cowley, D.E.30; Pfaffl, M.W.; Kuehn, R.30,32: Neuroscience letters 526 (2012) 122-127
Transkraniale, magnetische Stimulation ist eine nicht-invasive Methode der klinischen Diagnostik und Therapie bei physiologischen und psychologischen Krankheiten und findet verstärkt Verwendung in der experimentellen Neurophysiologie. Trotz alldem bleibt der Wirkmechanismus magnetischer Stimulation auf das zentrale Nervensystem immer noch unklar. Wir verwendeten sinus-artige, magnetische Felder mit hoher Frequenz in verschiedenen Stimulationsmustern und wiederholten Behandlungen an Zellkulturen, die aus dem frontalen Cortex muriner Embryonen (BALB/cOlaHsd Mäuse) gewonnen wurden, um auf die Effekte von repetitiver, magnetischer Stimulation auf die Gen-Expression von in vitro kultivierten neuronalen Zellen zu schließen. Gen-Expressions-Profile wurden anhand von qRT-PCR-Arrays und Einzel-qRT-PCR-Analysen bestimmt. Unsere methodische Herangehensweise mittels Mikroelektroden-Arrays minimiert Varianzen in der Transkriptom-Analyse, die aus dem Zell-Differentiations-Status und der Gewebekomplexität entstehen. Anhand der 10 signifikant regulierten Veränderungen in der Gen-Expression von insgesamt 171 Genen auf unterschiedlichen qRT-PCR-Arrays, die in Zusammenhang mit Alzheimer und Neurodegeneration stehen, konnten wir einen signifikanten Einfluss der repetitiven, magnetischen Stimulation auf das mRNA Transkriptom neuronaler Zellkulturen demonstrieren. 16 Kandidatengene wurden durch Einzel-qRT-PCR analysiert in einem repliziertem, statistischem Design, das genaueren Aufschluss über die Unterschiede der Expressions-Profile liefert. Wir diskutierten die Verwendbarkeit der experimentellen Methode zur Selektion der Zellkulturen sowie die Gen-Expressionen in Bezug auf ihre physiologischen Aspekte.

Forschung 2012

1        Lehrstuhl für Tierernährung, Technische Universität München

2        ZIEL – Research Center for Life and Food Sciences, Freising, Germany

3        Institute for Bioinformatics, LMU, Munich, Germany

4        Laboratory for Functional Genome Analysis (LAFUGA), Gene Center, LMU Munich, Germany

5        Chair for Molecular Animal Breeding and Biotechnology, Gene Center, LMU Munich, Germany

6        Laboratory for Functional Genome Analysis (LAFUGA), Gene Center, LMU Munich, Germany  

7        Institute for Animal Breeding, Bavarian State Research Center for Agriculture, Poing, Germany

8        Bavarian Research Center for Biology of Reproduction, Oberschleissheim, Germany   

9        Bavarian Health and Food Safety Authority, Oberschleissheim, Germany

10      Department of Animal Sciences, Center for Reproductive Biology, Washington State University,    Pullman, Washington

11      Chair for Pharmaceutical Technology and Biopharmaceutics, Department of Pharmacy, LMU    Munich, Germany

12      Institute for Plant Production and Plant Breeding, Bavarian State Research Center for Agriculture, Freising-Weihenstephan, Germany

13      ZIEL Dep. Nutritional Medicine, TUM, Freising-Weihenstephan, Germany

14      Klinikum rechts der Isar, TUM, München, Germany

15      Clinic for Cattle, University of Veterinary Medicine Hannover, Hannover, Germany

16      Institute of Anatomy, University of Veterinary Medicine Hannover, Hannover, Germany

17      Graduate School of Animal and Food Hygiene, Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine, Obihiro, Japan

18      Clinic of Reproductive Medicine, University of Zurich, Zurich, Switzerland

19      Leibniz-Institute for Molecular Pharmacology (FMP), Berlin, Germany

20      Bavarian State Research Center for Agriculture, Institute for Crop Science and Plant Breeding, Freising, Germany

21      National Research Centre on Yak, (ICAR), Dirang, West Kameng District, Arunachal Pradesh 790101, India

22      Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit (LGL), Oberschleißheim, Germany

23      Department of Chemistry and Pharmacy – Emil Fischer Center, University of Erlangen-Nuremberg, Erlangen, Germany

24      Fraunhofer Institute for Process Engineering and Packaging (IVV), Freising, Germany

25        EMBL Heidelberg, Genomics Core Facility, Heidelberg, Germany

26        Genomatics GmbH, Munich, Germany

27      Department of Statistics, LMU Munich, München, Germany

28      IMGM Laboratories GmbH, Martinsried, Germany

29      SIRION Biotech, Martinsried, Germany

30      Unit of Molecular Zoology, Chair of Zoology, Department of Animal Science, Life Science Center, TUM, Freising, Germany

31      Therapeutic Electromagnetic Osteopathy, Munich, Germany         

32      Program in Molecular Biology,New Mexico State University, Las Cruces, NM 88003-8003, USA    

Forschung 2012

 

© Lehrstuhl für Tierphysiologie und Immunologie    

    Letzte Änderung: 29.10.2015