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Forschungsaktivitäten 2014

I.   Laktationsphysiologie

II.  Wachstumsphysiologie und Anabolika

III.  Bioanalytik

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Lehre/internationale Kooperationen

Das EU Tempus Project „PhD in Food Science & Technology & Creating Capacities for PhD Reform at the University of Prishtina / Kosovo” (PhD@UP) http://www.phdatup.org/

wurde ins Leben gerufen um an der Universität Pristina, Kosovo (UP) ein neues, mit den Bologna Richtlinien konformes PhD Programm im Bereich Lebensmittelwissenschaften und Lebensmitteltechnologie zu etablieren. Hierbei waren drei Fakultäten der Universität Pristina involviert: die Fakultät für Medizin, die Fakultät für Landwirtschaft und Veterinärwesen sowie die Fakultät für Naturwissenschaften.

Zusammen mit internationalen EU Partnern wurde dieses Tempus Projekt (ein Finanzierungsprogramm der EU) entwickelt. Vertragspartner des Projektes war die Universität Graz (Österreich) und die Projektkoordination wurde von WUS Austria (Graz, Österreich) übernommen. Hauptinitiatoren war neben der Universität Pristina und der Universität Graz die TU München, genauer der Lehrstuhl für Physiologie, Weihenstephan. Weitere EU Partner waren die Universität von Granada (Spanien), die Universität von Vaasa (Finnland), der Austrian Exchange Service (Österreich), die Unabhängige Union von Studenten an der Universität Pristina (Kosovo), das Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Technologie des Kosovo und die Studentenliste Reforma (Kosovo). Zusammen mit diesen Partnern wurden verschiedene Arbeitspakete entwickelt um ein neues PhD Programm an der Universität Pristina, Kosovo zu etablieren und es den ersten 15 Studenten zu ermöglichen innerhalb dieses Programmes zu promovieren.

Die Technische Universität München war mit Herrn Prof. Heinrich Meyer und später mit Herrn Prof. Michael Pfaffl für die Entwicklung und Akkreditierung eines interdisziplinären PhD Pilot Projektes an der UP und die Bildung von Kapazitäten für die Durchführung des Pilotprojektes an den drei beteiligten Fakultäten der UP verantwortlich.

Innerhalb dieses dreieinhalb Jahre dauernden Projektes (Januar 2011 – Oktober 2014) wurden verschiedene Workshops von Seiten der TU München organisiert. Hierbei stand zum einen die Entwicklung einer Liste von Vorlesungen und Seminaren, welche die Studenten absolvieren sollten auf dem Programm. Ausserdem wurde innerhalb dieser Workshops eine Analyse der lokalen Bedürfnisse an der UP durchgeführt, wobei unter anderem eine Liste von Laborgeräten zu erstellen war, welche innerhalb dieses Projektes an der UP angeschafft werden sollten, um den beteiligten Studenten die Durchführung von Analysen für ihre Doktorarbeit zu ermöglichen. Nach der Einrichtung zweier neuer Labore wurden von TU Wissenschaftlern noch 2 Praktika organisiert um einigen Wissenschaftlern und Studenten an der UP die Möglichkeiten der Anwendung der angeschafften Geräte näher zu bringen.

Im letzten Teil des Projektes kamen die PhD Studenten aus Pristina für einen Monat an verschiedene Lehrstühle der TU München (Lehrstuhl für Tierhygiene, Lehrstuhl für Tierernährung, Lehrstuhl für Lebensmittelverfahrenstechnik und Molkereitechnologie und Lehrstuhl für Physiologie), um dort neue biotechnologische Technologien, welche für ihre Doktorarbeit relevant sind zu erlernen und eventuell einen Co-Mentor für ihre Arbeit zu finden.

Das Projekt wurde im Oktober 2014 beendet. Innerhalb des Projektes konnten alle Studenten die ersten beiden Semester mit Vorlesungen und Seminaren aus den verschiedensten Bereichen der Lebensmittelwissenschaften und Lebensmitteltechnolgie absolvieren. Zu diesen Lehrveranstaltungen wurden auch Gastdozenten der TU München nach Pristina eingeladen. Die Planung und Durchführung der einzelnen Doktorarbeiten dauert noch an und sollte innerhalb der nächsten 2 Jahre abgeschlossen sein.

 

I.  Laktationsphysiologie

Genexpressionsanalyse von Proteinsynthesepathways in bovinen Euterepithelzellen gewonnen aus Milch während der Laktation und während einer kurzzeitigen Futterrestriktion

Gene expression analysis of protein synthesis pathways in bovine mammary epithelial cells purified from milk during lactation and short-term restricted feeding

Sigl, T.; Meyer, H.H.D.; Wiedemann, S.[1]: J Anim Physiol Anim Nutr 98 (2014) 84-95

Das Ziel der Studie war die Untersuchung ausgewählter Schlüsselfaktoren der Milchproteinbiosynthese in primären bovinen Euterepithelzellen von Milchkühen in den ersten 155 Laktationstagen. Ergänzend wurden die Kühe in verschiedenen Laktationsstadien (Woche 4 und 21 pp) einer kurzzeitigen Futterrestriktion ausgesetzt, um die Anpassungsprozesse der molekularen Proteinbiosynthese an die metabolische Herausforderung zu untersuchen. Morgengemelksproben von 24 Holstein-Friesian Kühen wurden während der Versuchsperiode genommen (10 pro Tier). Die Euterepithelzellen aus Rohmilch wurden mittels einer immunomagnetischen Separationstechnik gewonnen und für real-time quantitative PCR Studien verwendet. Wie es in den Transkripten aller majoren Milchproteine gezeigt werden konnte, nahmen die mRNA Levels von E74-like factor 5, ein Verstärker der Signaltransduktion und Aktivator der Transkription (STAT), kontinuierlich bis zur Mittlaktation ab. Die Expression von ELF5 sowie der Milchproteingene zeigten einen ähnlichen Anstieg während der Futterrestriktion in der Frühlaktation. Gelegentliche Veränderung in der Expression konnten in anderen Faktoren der Janus Kinase (JAK)/STAT und in Elementen des Mammalian Target of Rapamycin (mTOR) Pathways gefunden werden. Aminosäure-, Glukosetransporter und die Kasein Expression waren ebenfalls teilweise verändert. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse eine Schlüsselrolle des Transkriptionsfaktors ELF5 bei der Milchprotein mRNA Expression mit gegenseitig ergänzenden Signalen des JAK/STAT und mTOR Pathways auf die Regulation der Proteinbiosynthese in der bovinen Milchdrüse.

 

Effekte des Durchmelkens in einem Feldversuch auf die Produktivität, Milchproteinertrag und Gesundheit von Milchkühen

Effects of continuous milking during a field trial on productivity, milk protein yield and health in dairy cows

Köpf, M.; Gellrich, K.; Küchenhoff, H.[2]; Meyer, H.H.D.; Kliem, H.: Animal 8:7 (2014) 1130-1138

Das Ziel dieser Feldstudie mit einem automatischen Melksystem war, zu untersuchen, ob das Weglassen der Trockenstehphase Auswirkungen auf die Gesundheit und Produktivität von Milchkühen in der darauffolgenden Laktation hat. Insgesamt wurden 98 Fleckviehkühe von 6 süddeutschen landwirtschaftlichen Betrieben zufällig in 2 Versuchsgruppen eingeteilt: Die erste Gruppe wurde 56 Tage vor der Abkalbung trocken gestellt (Gruppe D, n = 49), die zweite Gruppe wurde während dieser Zeit bis zur Abkalbung durchgemolken (Gruppe CM, n = 49). Aus dieser Gruppe bildete sich eine dritte Gruppe von Kühen, die sich selbst spontan trockenstellten (Gruppe DS, n = 14). Glukose, ?-Hydroxybutyrat (BHBA), nicht veresterte Fettsäuren (NEFA) und IGF-1 im Blut zeigten sehr ausgeprägte Schwankungen in der Gruppe D. Während der gesamten Versuchsdauer waren die Konzentrationen von BHBA und NEFA merklich geringer in den Gruppen CM und DS. Außerdem hatte die Gruppe D die niedrigste IGF-1 Konzentration und zeigte auch einen stärkeren Abbau der Rückenfettdicke als die anderen Gruppen. Die Milchproteinkonzentration war merklich höher in den Gruppen CM und DS (3,70 % und 3,71 %) im Vergleich mit der Gruppe D (3,38 %). Wegen der geringeren 305-Tagesleistung (-15,6 %) und der geringeren totalen Milchleistung (-3,1 %) war die totale Milchproteinmenge in der darauffolgenden Laktation um 2,5% (6,8 kg) geringer, obwohl die zusätzliche Milchproteinmenge der Gruppe CM von Woche -8 bis zur Abkalbung 35,7 kg betrug. Der größte Gewinn resultierte aus den positiven Effekten auf die Fruchtbarkeit und die geringere Krankheitsanfälligkeit: Die Kühe der Gruppe CM hatten ihren ersten Östrus 1 Woche früher im Vergleich zu den Kühen der Gruppe D. Sie nahmen auch früher auf und hatten ein signifikant geringeres Risiko, an Hypokalcämie, Ketose und Nachgeburtsverhalten zu erkranken. Die Studie zeigte außerdem, dass die tierärztlichen Behandlungskosten und der Milchverlust in der Gruppe D zweimal so hoch waren als in den Gruppen CM und DS. Somit überwogen die geringeren Kosten aufgrund besserer Gesundheit der CM und DS Kühe den finanziellen Verlust durch die geringere Milchleistung um + 18,49 € pro Kuh und Laktation.

Zusammensetzung der Hauptproteine in Milch von Kühen mit unterschiedlicher mittlerer Proteinkonzentration während der ersten 155 Tage der Laktation und unter Einfluss der Jahreszeit sowie kurzfristiger restriktiver Fütterungen in Früh- und Mittlaktation

Composition of major proteins in cow milk differing in mean protein concentration during the first 155 days of lactation and the influence of season as well as short-term restricted feeding in early and mid-lactation

Gellrich K.; Meyer H.H.D.; Wiedemann S.[3]: Czech J. Anim. Sci., 59 (2014): 97-106 

Eine Vielzahl von Proteinen trägt stark zur einzigartigen Stellung von Kuhmilch in der Ernährung und der Weiterverarbeitung bei. Besonders Gehalt und Zusammensetzung von Kasein haben beträchtlichen Einfluss auf die Möglichkeiten der Verarbeitung. In der vorliegenden Studie wurde die Milch von 23 mehrkalbigen Holstein-Friesian Kühen, gruppiert in hoch- (3.49 ± 0.05%; n = 11) und niedrig-Protein-Kühe (3.03 ± 0.05%; n = 12), ungefähr einmal die Woche während der ersten 155 Tage der Laktation beprobt, um den Verlauf der relativen Milchproteinkonzentration (?-Lactalbumin; ?-Lactoglobulin; ?-, ?-, und ?-Kasein) zu bestimmen. Des Weiteren wurden Futterrestriktionen (-30% der Trockenmasseaufnahme) in der Früh- und Mittlaktation sowie Gewebebiopsien durchgeführt, um deren Effekt auf die Milchproteinzusammensetzung zu beobachten. Die Zusammensetzung der Milchproteine war relativ konstant und zeigte während des Versuchszeitraums ähnliche Konzentrationsverläufe in beiden Gruppen. Die durchschnittlichen relativen Konzentrationen von ?-, ?-, ?-Kasein, ?-Lactalbumin und ?-Lactoglobulin waren 34,2, 31,4, 16,0, 2,1 und 9,7% des totalen Proteingehalts. Durch die Futterrestriktionen änderte sich die Milchproteinzusammensetzung nicht, während die Jahreszeit ?- und ?-Kasein sowie ?-Lactalbumin beeinflusste. Außerdem wurde in beiden Gruppen ein Effekt zu Zeiten ungewohnt stressiger Situationen durch die Entnahme von Leber- oder Muskelgewebeproben beobachtet. Als Ergebnis erhöhte sich die relative Konzentration von ?-Kasein. Demzufolge scheinen akute Stressfaktoren zu einer Veränderung der Milchproteinzusammensetzung zu führen und sollten vermieden werden.

 

Microfluidic high-throughput reverse-transcription quantitative PCR Analyse der Genexpression in der Leber von laktierenden Tieren

Microfluidic high-throughput reverse-transcription quantitative PCR analysis of liver gene expression in lactating animals

Viturro, E.; Altenhofer C.; Zölch, B.; Burgmaier, A.; Riedmaier, I.; Pfaffl, M.W.: Microchimica Acta October 181 (2014) 1725-1732

Wir haben eine microfluidic lab-on-chip quantitative reverse transcription (RT) quantitative PCR (qPCR) Methode evaluiert, indem wir die Genexpression von Schlüsselgenen des Lebermetabolismus von laktierenden Kühen gemessen haben. Es wurden Tiere in der frühen und in der späten Phase der Laktation ausgewählt, da hier extreme Anpassungen der Genexpression erwartet wurden. Während des Laktationszyklus waren 28 von 48 Genen signifikant reguliert, wobei erwähnenswert ist, dass sie identisch reguliert waren, wie bereits zuvor mit anderen Analysemethoden gezeigt wurde. Das zeigt, dass die high-throughput Plattform wegen ihrer Einfachheit, Schnelligkeit und geringeren Kosten eine attraktive Alternative zu Microarrays darstellt. Mit Hilfe des dynamischen PCA Algorithmus konnte ein Set aus 13 Genen eingegrenzt werden, welches es möglich machte, die beiden physiologisch verschiedenen Gruppen voneinander zu unterscheiden. Somit wurde der Weg bereitet, Tiere in verschiedenen metabolischen Situationen mit einem zuverlässigen microfluidic RT-qPCR Assay zu detektieren.

 

Effekte einer Raps- und Sojaöl ergänzten Ration auf den bovinen Fett Metabolismus sowie Fettsäuremuster  und Cholesteringehalt in der Milch.

Effects of rapeseed and soybean oil dietary supplementation on bovine fat metabolism, fatty acid composition and cholesterol levels in milk

Altenhofer, C.; Spornraft, M.; Kienberger, H.[4]; Rychlik, M.4; Herrmann, J. ; Meyer, H.H.D.; Viturro, E.: Journal of Dairy Research 81 (2014) 120-128

Das Hauptziel dieses Experiments war es, die Effekte einer Milchfettdepression, induziert durch eine mit pflanzlichen Ölen ergänzten Ration, auf den bovinen Fettmetabolismus, mit besonderem Interesse an dem Cholesteringehalt, zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden 39 Kühe in drei Gruppen eingeteilt, in denen verschiedene Rationen gefüttert wurden: eine Kontrollgruppe (C) ohne Ölergänzung und zwei Gruppen mit zugesetztem Soja (SO) oder Rapsöl (RO). In beiden Gruppen mit Ölzusätzen konnte eine bedeutendere Reduzierung des Milchfetts (1,14% in der SO Gruppe und 0,98% in der RO Gruppe) im Vergleich zur Kontrollgruppe (0,15%) erreicht werden. Es konnte kein signifikanter Unterschied des Protein und Laktosegehalts festgestellt werden. Der Milchcholesteringehalt war geringer in den Rationen mit Ölergänzung verglichen mit der Kontrollration, wogegen der Blutcholesteringehalt in diesen Rationen deutlich erhöht war. Das Fettsäuremuster zeigte bei den Versuchsgruppen mit zugesetzten Ölen eine deutliche Reduktion von über 10% bei den gesättigten Fettsäuren und einen hochsignifikanten Anstieg bei den einfach- und mehrfach ungesättigten Fettsäuren inklusive konjugierten Linolsäuren. Die Ergebnisse dieses Experiments deuten darauf hin, dass zur Ration zugesetzte Öle einen hohen Einfluss auf die Milchfettzusammensetzung und damit eine große Bedeutung für die menschliche Gesundheit haben, indem Fette mit potentiellen negativen Effekten, wie gesättigte Fettsäuren und Cholesterin, gesenkt werden und gleichzeitig solche mit positiven Eigenschaften wie einfach- und mehrfach ungesättigte Fettsäuren und konjugierte Linolsäuren erhöht werden.

 

Effekte einer einjährigen Gefrierlagerung mit verschiedenen Konservierungsmitteln auf die Milchcholesterin-, Progesteron- und Laktoferrinbestimmung

Effects of one year long-term freezing with different preservatives on milk cholesterol, progesterone and lactoferrin determination

Altenhofer, C.; Pfaffl, M.W.; Viturro, E.: International Journal of Dairy Technology

67 (2014) 490–494

Diese Studie wurde durchgeführt, um Effekte einer Langzeitgefrierlagerung auf die Milchzusammensetzung zu erheben und mögliche Einflüsse von vier verschieden Konservierungsmitteln (Azidiol, Kathon CG, NaOH und Thiomersal) auf die Bestimmung von Milchcholesterin, Progesteron und Laktoferrinkonzentration zu untersuchen. Milchproben wurden gesammelt, in Aliquote aufgeteilt und bei -20°C in 10ml Plastikröhrchen gelagert und nach 1, 6 und 12 Monaten aufgetaut und analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass Konservierungsmittel nicht für jede Analysemethode geeignet ist. Konservierungsmittel und Lagerungsbedingungen von Milchproben müssen für jedes Studiendesign sorgfältig bestimmt werden - abhängig von den Parametern, die gemessen werden sollen.

 

II.      Wachstumsphysiologie und Anabolika

Grünes Licht für Small RNA Sequencing: Optimisierung der Extraktion von zirkulierenden RNAs aus Plasma

Optimization of Extraction of Circulating RNAs from Plasma – Enabling Small RNA Sequencing

Spornraft, M.; Kirchner, B.; Haase, B.[5]; Benes, V.5; Pfaffl, M.W.; Riedmaier-Sprenzel, I.: PLOS ONE 9(9) (2014):e107259

Es existieren mehrere Protokolle und Kits für die Extraktion von zirkulierenden RNAs aus Plasma mit dem Ziel einer anschließenden Quantifizierung von spezifischen Genen mittels RT-qPCR. Wegen sehr geringen Konzentrationen an zellfreien RNAs in Plasmaproben, ist die RNA Ausbeute nicht ausreichend, um Next-Generation Sequencing (NGS) Experimente durchzuführen. Diese Technologie ermöglicht eine ganzheitliche Hochdurchsatz- Charakterisierung des ganzen Transkriptoms und gilt als (künftige) Goldstandardmethode. Das Screening des kompletten Transkriptoms nach spezifischen Signaturen beschleunigt die Identifizierung von Biomarkern in den Bereichen molekulare Diagnostik, Krankheitsfrüherkennung und auch Lebensmittelkontrolle. Daher galt es als Ziel, eine Methode zur  RNA-Isolierung zu optimieren, um ausreichend hohe Mengen an RNAs aus bovinem Plasma zu extrahieren, sodass small RNA Sequencing (small RNA-Seq) ermöglicht wird. Ein erhöhtes Plasmavolumen (9ml) wurde mit einem adaptiven Protokoll für das Qiagen miRNeasy Serum/Plasma Kit in Kombination mit dem Vakuumsystem QIAvac24 Plus isoliert. 35ng Total-RNA wurden in der Library Preparation für die Sequenzierung mit der Illumina HiSeq2000 Plattform verwendet. Die Rohdaten wurden mittels einer Datenanalyse-Pipeline aus nicht-kommerziellen Software Lösungen ausgewertet. Die Sequenzierungs-Daten wurden auf ihre Qualität kontrolliert, gemäß richtigen Sequenzlängen ausgewählt und anschließend mit small RNA Referenzdatenbanken zur Annotation verglichen. Somit konnte der Gehalt an microRNAs und piRNAs im bovinem Plasma ermittelt werden. Die Extraktionsmethode und Datenauswertung ermöglichen zukünftige Studien, die es erlauben, die Zusammensetzung an microRNAs und piRNAs in verschiedenen Körperflüssigkeiten zu erforschen. 

 

Identifizierung eines potenziellen Genexpressions-Biomarker Musters in boviner Leber zum Nachweis des Missbrauchs von Wachstumsförderern 

Identification of a potential gene expression biomarker signature in bovine liver to detect the abuse of growth promoters.

Riedmaier, I.; Spornraft, I.; Pfaffl M.W.: Food Addit Contam Part A - Chem Anal Control Expo Risk Assess, 2014 (4): 641-649

Der Missbrauch anaboler Substanzen in der Tiermast ist ein allgegenwärtiges Problem. Das Verbot der Anwendung von Wachstumsförderern wird innerhalb der EU streng kontrolliert. Aber es gibt immer noch Verabreichungsmethoden, wie z.B. neu entwickelte Substanzen oder Hormon Cocktails, welche schwer zu detektieren sind. Deshalb ist die Idee zur Identifizierung von molekularen Biomarkern, welche auf die physiologischen Effekte der Behandlung basieren, in den Fokus der Wissenschaft getreten.

In einer vorherigen Studie konnten wir mRNA Biomarker Kandidaten in Leberproben identifizieren, welche es ermöglichten, unbehandelte Tiere von Tieren, welche mit einer Kombination aus Androgenen plus Östrogenen behandelt wurden, zu unterscheiden. In der aktuellen Studie sollten diese Kandidaten in Kälbern, welche entweder mit einer wachstumsfördernden Kombination aus Progesteron plus Östradiol oder mit Clenbuterol behandelt wurden, bestätigt werden.

Hierfür wurde die Expression der Kandidatengene in der Leber dieser behandelten Kälber mittels RT-qPCR quantifiziert. Mit Hilfe der dynamischen Hauptkomponentenanalyse konnte eine Signatur von 11 Genen herausgefiltert werden, welche eine Unterscheidung behandelter Tiere von unbehandelten Tieren, unabhängig von der applizierten Substanz, ermöglichte. Die Anwendung dieser Gensignatur in einem zusätzlichen Set unbehandelter Tiere resultierte in einer Hauptkomponentenanalyse, welche ebenfalls zu einer Separierung behandelter von unbehandelter Tiere führte.

Diese Studie zeigt, dass Genexpressions-Biomarker ein großes Potenzial haben physiologische Veränderungen, welche durch die applizierte Substanz verursacht werden, unabhängig von der verabreichten Substanz zu detektieren. Es sind aber noch zusätzliche Studien nötig, um das Spektrum anaboler Substanzen zu erhöhen, für welche diese Biomarker angewendet werden können.

 

Abb. 1:       Hauptkomponentenanalyse zur Unterscheidung behandelter und unbehandelter Tiere welche einen zusätzlichen Pool an Kontrolltieren beinhaltet. Kontrolltiere sind durch einen weißen Kreis, Tiere welche mit einer Kombination aus Progesteron plus Östradiol behandelt wurden sind durch eine grüne Raute, und Tiere welche mit Clenbuterol behandelt wurden sind mit einem roten Dreieck dargestellt.

 

Transkriptionelle Biomarkersignaturen in der Lebensmittelüberwachung

Transcriptional Biomarker Signatures in Food Safety

Spornraft, M.; Riedmaier-Sprenzel, I.; Pfaffl, M.W.: Proceedings, LGL 5. Fachtagung Gentechnik, p41 – 52, published August 2014, ISBN 978-3-945332-07-8

Die Erforschung des Zusammenhangs zwischen Ernährung und dem Gesundheitsstatus, sowie des Einflusses der Nahrung auf die Entwicklung von Krankheiten, ist für die Wissenschaft und für die Lebensmittelindustrie von zentraler Bedeutung. Notwendig ist es, dabei nicht nur die gesunden Inhaltsstoffe und deren Wirkungen zu untersuchen, sondern auch die Auswirkungen von gesundheitsschädlichen Substanzen und Lebensmittelkontaminationen. In der Fleischproduktion werden in vielen Ländern hormonelle Wachstums- und Leistungsförderer verwendet. Die Kontrollanalysen sind bisher substanzspezifisch. Um neue Wege in der Überwachung zu beschreiten, wird ein Nachweissystem benötigt, das unabhängig der verwendeten anabolen Substanzen funktioniert. Eine Alternative zu den substanzspezifischen Nachweisen ist die Untersuchung der physiologischen Veränderungen eines Organismus nach der Gabe von anabolen Agentien auf molekularer Ebene. Das Ziel ist nicht länger der direkte Nachweis, sondern das Erfassen der zellulären Reaktionen auf die Substanzen. Diese exogenen Einflüsse verursachen eine Modifikation auf der Genexpressions-Ebene und zeigen dadurch physiologische Effekte. Eine neue Herangehensweise bei der Suche nach alternativen Nachweisverfahren ist das Screening eines Individuums auf die physiologische Antwort auf Transkriptomebene.

In diesem Artikel wird aufgezeigt, dass Omik-Technologien die Erforschung von Genexpressionsveränderungen ermöglichen und dass sich die Anwendbarkeit von transkriptionellen Biomarkern in der Lebensmittelsicherheit bereits bestätigt hat. Auf der Suche nach Biomarkern helfen stets die neuesten Analysemethoden und biostatistischen Auswertungen. Abschließend wird beleuchtet, dass die Kontamination von Fleisch durch Anabolika trotz Verbot auch in Deutschland eine ernst zu nehmende Gefährdung darstellt, dass aber der vorgestellte Forschungsansatz der transkriptionellen Biomarkersignaturen genutzt werden kann, um gesundheitsgefährdende Praktiken in der Tiermast aufzudecken und so Lebensmittel sicherer zu machen.

 

III.    Bioanalytik

Posttranskriptionale regulatorische Netzwerke: Vom Expressionsprofilerstellen zur integrativen Analyse der mRNA und microRNA Daten.

Posttranscriptional Regulatory Networks: From Expression Profiling to Integrative Analysis of mRNA and MicroRNA Data.

Meyer, S.U.; Stoecker, K.; Sass, S.[6]; Theis, F.J.6; Pfaffl, M.W.: Methods Mol Biol. 1160 (2014) 165-188

Protein-kodierende RNAs werden post-transkriptional durch microRNAs, eine Klasse der kleinen nicht-kodierenden RNAs, reguliert. Erkenntnisse zu messenger RNA (mRNA) und microRNA (miRNA) regulatorischen Interaktionen unterstützen das Verständnis der Feinregulierung der Genexpression und vermögen möglicherweise eine bessere Abschätzung der Proteinsynthese. Jedoch berücksichtigen in silico Vorhersagen der mRNA-microRNA Interaktionen nicht den spezifischen Status des Transkriptoms des biologischen Systems und werden durch falsch positive verzerrt. Eine mögliche Lösung, um verlässlichere Vorhersagen für die mRNA-miRNA Beziehungen im spezifischen biologischen Zusammenhang zu treffen, ist es, sowohl echte mRNA und miRNA Transkriptomdaten als auch in silico Zielmolekül-Vorhersagen zu integrieren. Dieses Kapitel adressiert den Arbeitsablauf und Methoden, die man anwenden kann für sowohl die Erstellung des Expressionsprofils und die integrative Analyse der mRNA und miRNA Daten als auch die Interpretation der Ergebnisse und Modellerstellung der post-transkriptionalen regulatorischen Netzwerke.

Abb. 2:      Pfad-abhängige Veranschaulichung der miRNA–mRNA Beziehungen mit Cytoscape 2.8.3. Die Anreicherungen schließen sowohl die TargetScan-basierten miRNA–Zielmolekülvorhersagen als auch mRNA and microRNA Expressionsdaten mit ein. Die blauen Knoten repräsentieren microRNAs, wohingegen die grünen, gelben und roten Knoten die Gene darstellen. Die Farbintensität (rot = signi?kant, grün = nicht-signifikant) zeigt die Signifikanz eines Netzgebietes an, dass dies überrepräsentiert ist in einem bestimmten Pfad oder biologischen Zusammenhang. (a) Die Ergebnisse des Neurotrophin-Signalpfads sind beispielhaft dargestellt.

 

mRNA und microRNA Reinheit und Integrität:

Der Schlüssel zum Erfolg beim Erstellen von Expressionsprofilen

mRNA & microRNA Purity and Integrity: The Key to Success in Expression Profiling

Kirchner, B.; Paul, V.[7]; Riedmaier-Sprenzel, I.; Pfaffl, M.W.: (2014) Chapter 5 - Quantitative Real-Time PCR, edited by Roberto Biassoni and Alessandro Raso, lab protocol series Methods in Molecular Biology, published by Humana Press, USA, ISBN-10: 1493907328 Methods Mol Biol. 1160 (2014) 43-53

RNA Qualitätskontrolle ist ein maßgeblicher Schritt um intakte, nicht degradierte RNA zu garantieren und aussagekräftige Ergebnisse aus Microarray, RT-qPCR (Reverse Transkription quantitative PCR) oder Next-Generation-Sequencing (RNA-Seq oder small RNA-Seq) Gen-Expressions-Experimenten zu erhalten. Entsprechend ist das Bestimmen der RNA Integrität und Reinheit vor Gen-Expressionsanalysen der Proben RNA essentiell, um die Genauigkeit jeglicher nachfolgender Anwendungen zu garantieren. RNA Proben sollten weder degradiert noch fragmentiert und sowohl frei von Proteinen als auch von genomischer DNA, Nukleasen und enzymatischer Inhibitoren sein. Der Artikel beschreibt den aktuellen Stand der Technik zur Bestimmung der RNA Qualität unter Verwendung von UV/Vis Spektrophotometrie und Kapillar-Gelelektrophorese.


[1] Institute of Animal Breeding and Husbandry, Christian-Albrechts-University Kiel, Kiel, Germany

[2] Statistisches Beratungslabor, Ludwig-Maximilians-Universität München, Germany

[3] Institut für Tierzucht und -haltung, Christian-Albrechts-University Kiel, Kiel

[4] Bioanalytik Weihenstephan, ZIEL – Research Center for Nutrition and Food Sciences, Technische Universität Muenchen, 85354 Freising, Germany

[5] Genomics Core Facility, EMBL European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Germany

[6] Helmholtz Zentrum München, Institute of Computational Biology, Germany

[7] National Research Centre on Yak (ICAR), Dirang, Indien

 

 

 

© Lehrstuhl für Tierphysiologie und Immunologie    

    Letzte Änderung: 29.10.2015