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Forschungsaktivitäten 2015

I.    Bioanalytik

II.   Laktationsphysiologie

III.  Wachstumsphysiologie und Anabolika

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I.  Bioanalytik

Die MIQE Richtlinien in Genexpressionsstudien und der Biomarker Forschung
MIQE compliance in expression profiling and clinical biomarker discovery
Riedmaier, I.; Spornraft, M.; Kirchner, B.; Pfaffl, M.W.:
European Pharmaceutical Review VOLUME 20 ISSUE 6 2015

Molekulare Diagnostik und molekulare Biomarker sind in der klinischen Forschung immer bedeutender. Dies beinhaltet alle Bereiche der Diagnostik, wie Risikobewertung, Krankheits- und Behandlungsprognose und die Kontrolle des Behandlungserfolges. Die Detektion molekularer Biomarker kann auf verschiedenen molekularen Ebenene, wie dem Genom, dem Epigenom, dem Transkriptom, dem Proteom oder dem Metabolom erfolgen. Zur Identifizierung vom Markerkandidaten steht eine Vielzahl von Hochdurchsatz-Labormethoden zur Verfügung. Egal, auf welcher molekularen Ebene man nach Biomarkern forscht, eine gute Probenqualität und ein standardisierter und hoch reproduzierbarer Quantifizierungsablauf sind Voraussetzung. Der Artikel beschreibt eine optimierte Strategie um Biomarker auf Transkriptomebene zu entdecken und zu validieren, welche die kürzlich veröffentlichten „MIQE guidelines“ befolgt. Fokus liegt dabei auf die Bedeutung von Probenqualität, RNA Integrität, vorhandene Labortechnik und biostatistische Methoden zur Datenauswertung.

Wie gut ist die qPCR Effizienzschätzung? Empfehlungen für eine präzise und robuste Bestimmung der qPCR Effizienz.
How good is a PCR efficiency estimate: recommendations for precise and robust qPCR efficiency assesment
Svec, D.[1],[2]; Tichopad, A.[3]; Novosadova, V.19,20; Pfaffl, M.W.; Kubista, M.19,20:  Biomolecular Detection and Quantification 2015 3: 9–16 

Die Effizienzbestimmung in der qPCR ist einer der wesentlichen Parameter in der quantitativen PCR (qPCR) und ein essentieller Bestandteil der MIQE Guidelines. Gerade bei der absoluten Quantifizierung in der molekularen Diagnostik, kommt der PCR Effizienz eine Schlüsselrolle zu. Einen großen Einfluss auf das quantitative Ergebnis nehmen das experimentelle Design, die Anzahl der biologischen und technischen Replikate, sowie die Integrität der Eichgeraden. Im Weiteren sind das Reaktionsvolumen und die real-time PCR Hardware wesentlich für die Varianz und Richtigkeit der Ergebnisse. In dieser Studie wurden sechs real-time PCR Plattformen verglichen und Reaktionsvolumina in eine Vielzahl von Standardkurven getestet. Es stellte ich heraus, dass mindestens zwei Replikate in der Standardkurve nötig sein, empfohlen werden drei bis vier technische Replikate bei jeder Eichverdünnung. Die qPCR Effizienz ist stark Geräte-abhängig, aber stabil innerhalb einer Plattform. Mit größeren Volumina in der Eichgerade können Fehler, z.B. beim Pipettieren ausgeglichen werden und erlauben ein weiteren quantitativeren Bereich zu erfassen.

Editorial: Verbesserte molekulare Diagnostik zur Etablierung von Biomarkern.
Editorial: Advanced Molecular Diagnostics for Biomarker Discovery.
Guest editor’s introduction for special issue Biomolecular Detection and Quantification
Michael W. Pfaffl (2015): Biomolecular Detection and Quantification (2015) 5: 1–2

Fortschritte in der Molekularbiologie und Biotechnologie führen zu neuen Erkenntnissen in der Grundlagenforschung und zu einem besseren Verständnis der biologischen Zusammenhänge. Dabei spielen valide Biomarker und deren Muster / Signaturen eine Schlüsselrolle, v.a. in der Diagnostik, sowie in der Prävention oder Therapie. In der BDQ Spezialausgabe mit dem Titel „Advanced Molecular Diagnostics for Biomarker Discovery“ werden neue Entwicklungen, molekulare Techniken und deren praktische Anwendungen in der Forschung vorgestellt. Ein weiterer Schwerpunkt liegt auf der Datenauswertung komplexer Datensätze.

Für die Identifizierung molekularer Biomarker oder Biomarkersignaturen gibt es verschiedene molekulare Ebenen und analytische Plattformen. Es bietet sich die Möglichkeit der Untersuchung der genomischen DNA, die als Träger der Erbinformation die Basis für die Protein-Biosynthese darstellt (auf dem Genom-Level = Genomik). Die Erforschung der Modulation der DNA-Transkription als Folge eines äußeren Einflusses ist eine weiter Ansatzebene (Transkriptom-Level = Transkriptomik und Epigenetik-Level = Epigenomik), die resultierende Proteinzusammensetzung im Körper eine Weitere (Proteom-Level = Proteomik). Auch bei der Regulation der Protein-Biosynthese gelten verschiedene RNA Transkripte als Mediatoren (Transkriptomik). Diese sind zum einen Messenger RNAs (mRNA), die als Matrizen für die Proteinbiosynthese dienen und zum anderen nicht-proteinkodierende RNAs, z.B. microRNAs, die wiederum regulatorisch auf die mRNAs wirken. Des Weiteren können Metaboliten als biochemische Produkte im Stoffwechsel als Biomarker verwendet werden (Metabolom-Level = Metabolomik). Die verschiedensten Methoden und Techniken zur ganzheitlichen Analyse dieser Ebenen werden als „omik“-Technologien zusammengefasst.

Die 10 präsentierten Publikationen in dieser Spezialausgabe konzentrierten sich auf die Transkriptomik, speziell auf mRNA und microRNA Ebene und deren Werkzeuge RT-qPCR und RNA Seq, zur Etablierung von validen Biomarkermustern.

Nachweis von Eigenblutdoping: Erfassung von Veränderungen im Gen-Expressionsmuster in Blutkonserven nach definierter Lagerung
Henke, A., Pfaffl, M.W. (Projektleiter IIA1-070301/13); Henschler, R.[4]; Wichmann, C.22; Riedmaier, I.:  BISP-Jahrbuch Forschungsförderung 2014 – 2015, Bundesinstitut für Sportwissenssenschaft, erschienen im Dezember 2015, 39-46

Die World Anti Doping Agency (WADA) veröffentlicht jedes Jahr eine aktuelle Liste mit verbotenen Substanzen, Substanzgruppen sowie Dopingmethoden (WADA, 2014). Zu den verbotenen Methoden zählen auch Bluttransfusionen jeglicher Art und Herkunft. Eine Transfusion kann einerseits mit „Eigenblut“ als autologe Transfusion (Eigenblutdoping) oder andererseits mit „Fremdblut“ als allogene Transfusion (Fremdblutdoping) durchgeführt werden. Beim Eigenblutdoping können sowohl Vollblut (VB) als auch Erythrozytenkonzentrate (EK) zum Einsatz kommen. Letzteres wird aber vermutlich häufiger im Wettkampfdoping verwendet, da im EK die Konzentration der wichtigen sauerstofftransportierenden Erythrozyten (Hämatokrit) bei ca. 60 % anstatt bei ca. 36 % im Vollblut liegt (Ullrich, Stolecki & Grünewald, 2005). Die Kapazität des Sauerstofftransports kann somit nach dem Blutdoping im Sportler signifikant erhöht und dessen Leistung, abhängig von dem erhöhten Hämatokrit, gesteigert werden. Dies kann auf legalem Wege nur durch anhaltendes Höhentraining erreicht werden.
Da beim Eigenblutdoping keine Fremdsubstanz zugeführt wird, sind direkte Nachweismethoden hier nicht zielführend. Einzig die Kontrolle des Hämatokritwertes kann bis dato die Anwendung autologer Bluttransfusionen aufdecken. Aber solange der Hämatokritwert unterhalb des für die Sportart vorgeschriebenen Grenzwerts liegt, bleibt Eigenblutdoping bisher unentdeckt. Vielversprechende neue Ansätze zum Nachweis von Eigenblutdoping bieten indirekte Nachweismethoden auf Ebene des Transkriptoms.
Bei der Aufbereitung, Stabilisierung sowie der Lagerung des Vollblutes, bzw. der Erythrozytenkonzentrate, reagieren die „lebenden“ Blutzellen auf die veränderten Bedingungen und in direkter Folge ist mit physiologischen Reaktionen auf zelluläre Ebene zu rechnen. Mittels molekularbiologischer Methoden auf RNA Ebene konnten diese physiologischen Veränderungen in Form einer Änderung des Transkriptoms erfasst, quantifiziert und ein erstes Biomarkerset entwickelt werden.
Um diese Hypothese zu stützen, wurde zunächst eine Pilotstudie durchgeführt, welche die Veränderungen im Genexpressionsmuster, im Speziellen von microRNAs (miRNA) in Blutbeuteln nach definierter Lagerungszeit erfassen soll. Die Proben von 6 Probanden wurden mit der small RNA-Seq Technologie analysiert. Durch den definierten Cut-Off Wert von durchschnittlich 50 Reads pro miRNA, wurde die Anzahl der identifizierten miRNA von potentiellen 2578 auf 193 relevante miRNA reduziert. Diese 193  miRNAs wurden normalisiert, in die Software GenEx importiert und weiter analysiert. Diese Software bietet zusätzlich zur normalen Hauptkomponentenanalyse (Principal Component Analysis, PCA) eine sog. dynamische PCA (dPCA) an. Mit Hilfe der dPCA konnte ein Biomarkerset etabliert werden, welches es erlaubt zwischen den unterschiedlichen Behandlungen zu unterscheiden:  Proben aus dem Arm versus Proben aus dem Blutbeutel. Diese Clusterbildung basiert auf 10 höchst signifikant regulierte miRNA Biomarkern. Verglichen mit Kontrollgruppe hatte die Dauer der Lagerung keinen weiteren Einfluss.
Die Ergebnisse der multivariaten Datenanalyse PCA zeigen, dass die Blutlagerung einen bedeutenden Effekt auf das miRNA Profil im Blut hat. Es konnten eindeutig zwei verschiedene Cluster identifiziert werden, die einmal durch die Proben aus dem Arm und einmal durch die Proben aus dem Blutbeutel repräsentiert werden. Dies unterstützt die Hypothese, dass sich der „Puffer- und Lagereffekt“ auf die miRNA auch nach Transfusion von gelagerten EKs wiederfinden lässt. Die gewonnenen Daten sollen als Grundlage für eine neue Studie dienen, in welcher die resultierende Biomarkersignatur in gesunden männlichen Probanden nach Eigenblutdoping validiert werden sollen. Diese neue Biomarkersignatur könnte dann als Nachweis für Eigenblutdoping fungieren und den ABP (Athlete Biological Passport) ergänzen.

Entwicklung von RDML Ninja und einer RDML Datenbank für einen standarisierten Datentransfer von quantitativen PCR Datensätzen
RDML Ninja and RDML db for standardized exchange of qPCR data
Ruijter, J.M.[5]; Lefever, S.[6]; Anckaert, J.24; Hellemans, J.[7]; Pfaffl, M.W.; Benes, V.[8]; Bustin, S.A.[9]; Vandesompele, J.24,25; Untergasser, A.26,[10]; on behalf of the RDML consortium (2015): BMC Bioinformatics (2015) 16: 197

Die PCR findet heute Anwendung in allen Bereichen der molekularen Analytik und Diagnostik sowie in der Forschung jeglicher Lebenswissenschaften. Mit den MIQE Guidelines haben wir 2009 den internationalen qPCR Standard gelegt, die PCR voll quantitativ und hoch wiederholbar durchführen zu können. Was bis dato fehlt war die Standardisierung des Datentransfers, einerseits zwischen Laboren und deren Wissenschaftlern, als auch zwischen unterschiedlicher Hardware oder Softwarepaketen zur Datenauswertung. Mit RDML wurde ein Standard geschaffen der inzwischen auch mehr und mehr von der Industrie implementiert wird. Mit RDML-Ninja wollen wir nun den aktuellen Anforderungen Rechnung tragen um RDML Datensets zu visualisieren, zu editieren und zu validieren. Die neu etablierte RDMLdb (http://www.rdmldb.org) wird in Zukunft als RDML Datenbank fungieren, in der generierte Datensätze dokumentiert und gespeichert werden können. Dies ermöglicht eine Steigerung der Transparenz und ist ganz im Sinne der MIQE Guidelines zur Verbesserung der Datenqualität und qPCR Ergebnisse in Forschung und Diagnostik.

Next-Generation Sequenzierung des miRNomes und piRNomes in bovinem Blut und Plasma
Comparison of the miRNome and piRNome of bovine blood and plasma by small RNA sequencing.
Spornraft, M.; Kirchner, B.; Pfaffl, M.W.; Riedmaier, I.: Biotechnol Lett. 2015 Jun;37(6):1165-76. doi: 10.1007/s10529-015-1788-2. Epub 2015 Feb 21.

Das small RNA Spektrum im bovinen Plasma und Vollblut wurde mittels Next-Generation Sequencing analysiert, um die microRNA (miRNA) und PIWI-interacting small non-coding RNA (piRNA) Signaturen in diesen beiden Bioflüssigkeiten zu beschreiben, zu quantifizieren und zu vergleichen.

Die Evaluierung der sequenzierten Read-Daten resultierte in einer Beschreibung der Abundanz der miRNAs und piRNAs. So konnten in Plasma 5.0 ± 2.9 % miRNAs und 38.2 ± 3.4 % in Vollblut identifiziert werden. Der Anteil an piRNAs war mit 1.4 ± 0.8 % in Plasma und 1.9 ± 0.8 % in Vollblut in beiden Proben konstant. Die diskriminierende Analyse der Top 10 exprimierten miRNAs und piRNAs verdeutlichte, dass zwei miRNAs und sieben piRNAs in beiden Bioflüssigkeiten identisch vorlagen. Ein Vergleich der sequenzierten Readcounts dieser simultan exprimierten small RNAs zeigte auf, dass die Vollblut miRNA und piRNA Levels die entsprechenden Konzentrationen in Plasma überschritten. Eine Ausnahme stellte miR-122 dar, die zwar leberspezifisch synthetisiert wird, aber die weiteren Funktionen und der Transport im Organismus unerforscht bleiben.

Die ermittelten Daten konkretisierten die Vermutung, dass das Spektrum an zirkulierenden small RNAs im Plasma nicht nur durch Hematocyten bedingt ist, sondern diverse small RNAs an anderer Stelle im Organismus synthetisiert werden und dann in den Blutkreislauf abgegeben werden.

Expression von Geruchs- und Geschmacksrezeptoren in Blutleukozyten.
Class-I odorant receptors, TAS1R and TAS2R taste receptors are expressed in blood leukocytes.
Malki, A.[11]; Fiedler, J.29; Fricke, K.29; Ballweg, I.; Pfaffl, M.W.; Krautwurst, D.29: Journal of Leukocyte Biology 2015 97(3): 533-545

Gerüche und Geschmack spielen eine viel größere Rolle in unserem Leben und in der Immunabwehr als bisher angenommen. Es konnten eine Vielzahl von Riech- und Geschmacksrezeptoren auf Leukozyten isoliert aus humanem und Rinderblut identifiziert werden. Das zelluläre Immunsystem ist bei jeder Nahrungsaufnahme postprandial mit neuen Antigenen konfrontiert, nicht nur im Verdauungstrakt sondern auch im Blut. Hier können die Geruchs- und Geschmacksrezeptoren auf den Leukozyten eine Schlüsselrolle bei der spezifischen Abwehr oder bei der Aktivierung des Immunsystems einnehmen.
In der durchgeführten Studie konnten eine Vielzahl der Klasse 1 Geschmacksrezeptoren in 5 verschiedene Populationen von Blutleukozyten in Mensch und Rind identifiziert werden. Dies deutet auf ein evolutionäres Konzept hin. Einige Rezeptoren sind konstant über viele Leukozyten Populationen koexprimiert, und andere zeigen große individuelle Unterschiede in der Expression. Dies lässt sehr wahrscheinlich auf eine nahrungs- oder antigenabhängige Regulation dieser Rezeptoren schließen. Zusammenfasend kann man sagen, dass diese Ergebnisse die Existenz von chemo-sensorischen Leukozyten in der Zirkulation von Mensch und Rind zeigen.

[1] Institute of Biotechnology, Academy of Science of the Czech Republic, Prague, The Czech Republic; 

[2] TATAA Biocenter, Gothenburg,

[3] Faculty of Medicine Pilsen, Charles University, Pilsen, Czech Republic

[4] Klinikum der Ludwig-Maximilians-Universität München, Abteilung für Transfusionsmedizin, Zelltherapeutika und Hämostaseologie

[5] Department of Anatomy, Embryology & Physiology, Academic Medical Center, Amsterdam, 1100AZ,
The Netherlands

[6] Center for Medical Genetics, Ghent University, Gent, B-9000, Belgium; 

[7] Biogazelle, Zwijnaarde, 9052, Belgium; 

[8] Genomics Core Facility, European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, 69117, Germany;

[9] Postgraduate Medical Institute, Anglia Ruskin University, Chelmsford CM1 1SQ, UK; 

[10] Center of Molecular Biology (ZMBH), Heidelberg University, Im Neuenheimer Feld 282, Heidelberg, 69120, Germany

[11] Deutsche Forschungsanstalt für Lebensmittelchemie Leibniz Institute, Lise-Meitner-Str. 34, 85354 Freising, Germany;

II.    Laktationsphysiologie

Zeitliche Variation von Milchfettkügelchen-Durchmesser, Fett- und Cholesterin Gehalt und Genexpression der Milchepithelzellen von Milchkühen
Temporal variation of milk fat globule diameter, fat and cholesterol content and milk epithelial cell gene expression in dairy cows
Altenhofer, C.; Holzmüller, W.1; Wolfertstetter, F.; Wolfschoon Ribeiro, D.; Kulozik U.[1]; Pfaffl M.W.; Viturro, E.: International Journal of Dairy Technology (2015)

Es war möglich eine Beziehung zwischen der zeitlichen Variation des Milchfettkügelchen-Durchmessers, Fett- und Cholesteringehalt der Milch und der Expression von Kandidatengenen in Euterepithelzellen in Milch zu zeigen. Am Beginn der Laktation korrelierten höhere Gehalte von Fett und Cholesterin in der Milch mit einer höheren Expression von Schlüsselenzymen in reinen, bovinen Milchepithelzellen begleitet von einer Vergrößerung der durchschnittlichen Milchfettkügelchen-Größe.

miRNA in nativer und prozessierter Kuh-Milch und sein Einfluss auf den “Bauernhof Milch Effekt“ für Asthma
miRNA in native and processed cow’s milk and its implication for the farm milk effect on asthma.
Kirchner, B.; Pfaffl, M.W.; Dumpler, J.1; von Mutius, E.[2]; Ege, M. 2:
Journal of Allergy and Clinical Immunology (accepted October 2015)

Hintergrund:Kinder, die regelmäßig unverarbeitete Kuh-Milch direkt vom Bauern konsumieren, haben ein geringeres Risiko an Asthma zu erkranken als Kinder, die industriell prozessierte Milch konsumieren. Kuh-Milch enthält miRNA, eine Molekülklasse mit immun-regulativen Eigenschaften, die schon in Zusammenhang mit der Entwicklung von Asthma gebracht wurden.Ziel der Studie:Es wurde getestet ob die industrielle Prozessierung von Kuh-Milch das miRNA Profil verändert und ob betroffene miRNAs bekannte Asthma Gene beeinflussen. Methoden:Milch von 3 unterschiedlichen Farmen wurde verschiedenen industriellen Prozessierungsverfahren unterzogen. RNA wurde extrahiert sequenziert mittels Small RNA Next-Generation-Sequencing und durch RT-qPCR für ausgewählte miRNAs validiert. Experimentell bestätigte Ziele der differentiell exprimierten miRNAs wurden aus mirTarbase v4.0 gewonnen und der Fokus wurde auf 139 Kandidatengene für Asthma, Atopie und Atemwegsinfektionen gelegt.Ergebnisse:miRNA Sequenzen waren reduziert in allen Milchproben mit Hochtemperatur-Behandlungen (abgekocht, UHT, ESL) aber unterschieden sich nicht zwischen den einzelnen Bauerhöfen. Expression-Level der Let-7 Familie und anderen miRNAs waren stark beeinflusst von Hochtemperatur-Behandlungen und Fettgehalt (z.B. log2-fache Veränderung für let-7a-5p: 4,01 bzw. 1,54). Hochtemperatur-Behandlungen beeinflussten hauptsächlich miRNAs, die in die Expression von STAT3, PTGS2, IL-6, IL-13, IFNG und IFNGR1 eingreifen. Ebenso reduzierte die Entfettung die Expression von miRNAs, die auf STAT3 wirken.Zusammenfassung:Industriell prozessierte Milch, besonders solche mit Hochtemperatur-Behandlungen, reduziert miRNAs die „Asthma Gene“ beeinflussen. Dieser Mechanismus könnte am positiven Effekt von unprozessierter Milch auf Asthma beteiligt sein.

Unterschiede in der Milchfettzusammensetzung von vier verschiedenen Schafrassen
Differences in milk fat composition from four old sheep breeds.

Viturro, E.; Schlattl, M.; Kienberger, H.[3]; Rychlik, M.3; Pfaffl, M.W.; Frölich, K.[4]:
Archives Animal Breeding (2015) 58: 351–353
In der vorliegenden Arbeit wird die Milchfettzusammensetzung von vier alten Schafrassen verglichen. Alle Tiere wurden mit der gleiche Ration gefüttert und am gleichen Laktationstag beprobt. Die majoren Inhaltstoffe, Cholesterin und ein komplettes Fettsäureprofil wurden in allen Milchproben bestimmt. Die Rasse Walachian wurde, auch im Vergleich mit modernen Schafrassen, als Kandidat mit gesunder Milchfettzusammensetzung festgestellt.

[1] Chair for Food Process Engineering and Dairy Technology, Technische Universität München, Freising, Germany;

[2] Dr. von Hauner Children’s Hospital, Ludwig Maximilian University, Munich, Germany, member of the German Center for Lung Research (DZL)

[3] Department of Analytical Food Chemistry, Technische Universität München

[4] Tierpark Arche Warder e.V.

 

III. Wachstumsphysiologie, myotrope Therapeutika und Anabolika

TNF-? und IGF1 modifizieren die microRNA-Signatur in der Skelettmuskeldifferenzierung.
TNF- and IGF-1 modify the microRNA signature in skeletal muscle cell differentiation.
Meyer, S.U.; Thirion, C.[1]; Polesskaya, A.[2]; Bauersachs, S.[3]; Kaiser, S.[4]; Krause, S.[5]; Pfaffl, M.W.: Cell Communication & Signaling (2015) 13: 4

Hintergrund:
Erhöhte Werte des inflammatorischen Zytokins, TNF-?, sind üblich in chronischen Krankheiten, ererbten oder degenerativen Muskelkrankheiten und können zu Muskelschwund führen. Im Gegensatz dazu hat IGF1 einen wachstumsfördernden Effekt auf den Skelettmuskel. Die molekularen Mechanismen, die den Effekt von TNF-? und IGF1 auf die Muskelzelldifferenzierung vermitteln, sind nicht vollständig verstanden. Muskelzellproliferierung und –differenzierung werden durch microRNAs (miRNAs) reguliert, die eine dominante Rolle in diesem Prozess spielen. Diese Studie zielt darauf zu erklären wie TNF-? oder IGF1 die microRNA-Expression regulieren und somit die Myoblastendifferenzierung und Myotubenbildung beeinflussen. 

Ergebnisse:
In dieser Studie analysierten wir den Einfluss von TNF?- oder IGF1-Behandlung auf die miRNA-Expression in myogenen Zellen. Die Ergebnisse offenbaren, dass i) TNF-? und IGF1 die miRNA-Expression während der Skelettmuskelzelldifferenzierung in vitro regulieren, ii) microRNA-Zieltranskripte den negativen Effekt von TNF-? auf die Fusionsfähigkeit der skelettartigen Myoblasten vermitteln können durch das Zielen auf Gene, die assoziiert sind mit Axon-Führung, MAPK-Signalweg, fokaler Adhäsion und Neurotrophin Signalweg, iii) Inhibierung von miR-155 in Kombination mit Überexpression von miR-503 den inhibitorischen Effekt von TNF- ? auf die Myotubenbildung teilweise aufheben kann und iv) MAPK/ERK-Inhibierung möglicherweise an der Modulierung des Effekts von TNF-? und IGF1 auf die miRNA-Häufigkeit beteiligt ist.

Schlussfolgerungen:Die inhibitorischen Effekte von TNF-? oder Wachstumsfördernden Effekte von IGF1 auf die Skelettmuskelzelldifferenzierung schließen die Deregulierung von bekannten Muskel-regulatorischen miRNAs mit ein sowie miRNAs, welche bisher noch nicht mit der Skelettmuskeldifferenzierung oder der Antwort auf TNF-? oder IGF1 verbunden wurden. Diese Studie weist darauf hin, dass miRNAs Mediatoren des inhibitorischen Effektes von TNF-? auf die Myoblastendifferenzierung sind. Wir zeigen, dass Intervention auf der miRNA-Ebene den negativen Effekt von TNF-? verbessern kann, indem die Myoblastendifferenzierung gefördert wird. Zudem machen wir unter Vorbehalt den Vorschlag, dass TNF-? oder IGF1 die miRNA-Biogenese von einigen miRNAs über den MAPK/ERK-Signalweg moduliert. Schließlich identifiziert diese Studie indikative Biomarker der Myoblastendifferenzierung und des Zytokineinflusses und weist auf neue RNA-Zieltranskripte hin.

Integrative Analyse von microRNA und mRNA Daten offenbart eine orchestrierte Funktion der microRNAs in der skelettartigen Myocytendifferenzierung als Antwort auf TNF-? oder IGF1.
Integrative analysis of microRNA and mRNA data reveals an orchestrated function of microRNAs in skeletal myocyte differentiation in response to TNF- or IGF1.
Meyer, S.U.; Sass,S.[6]; Mueller, N.S10; Krebs, S.[7]; Bauersachs, S.11; Kaiser, S.[8]; Blum, H.11; Thirion, C.[9]; Krause, S.[10], Theis, F.J.10,[11], ; Pfaffl, M.W.: PLoS One 2015 10(8): e0135284

Einleitung:
Skelettmuskelzelldifferenzierung wird beeinträchtigt durch erhöhte Werte des inflammatorischen Zytokins, Tumornekrosisfaktor-? (TNF-?), mit pathologischer Signifikanz in chronischen Krankheiten oder geerbten Muskelkrankheiten. Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor-1 (IGF1) reguliert die Muskelzelldifferenzierung positiv. Beide, TNF-? und IGF1, beeinflussen die Gen- und microRNA (miRNA)-Expression in diesem Prozess. Jedoch wird die computergestützte Vorhersage von miRNA-mRNA-Beziehungen herausgefordert durch Falschpositive und Zieltranskripte, die irrelevant in dem entsprechenden zellulären Transkriptomkontext sein mögen. Daher fokusiert sich diese Studie auf funktionale Informationen über die miRNA-beeinflussten Zieltranskripte, indem sie miRNA und mRNA Expressionsprofildaten integriert.

Methodik/Hauptergebnisse:
Murine skelettartige Myozyten, PMI28, wurden für 24h differenziert mit gleichzeitiger TNF?- oder IGF1-Behandlung. Beide, mRNA und miRNA Expressionsprofilmessungen wurden durchgeführt. Die Daten-getriebene Integration von Zieltranskriptvorhersage und gepaarter mRNA/miRNA Expressionsprofildaten zeigte, dass i) die Menge der vorhergesagten miRNA-mRNA-Beziehungen reduziert wurde, ii) miRNA-Zieltranskripte mit einer Funktion im Zellzyklus und in der Axon-Führung angereichert waren, iii) die differentielle Regulierung von anti-Differenzierungs miR-155-5p und miR-29b-3p sowie pro-Differenzierungs miR-335-3p, miR-335-5p, miR-322-3p, und miR-322-5p von primärer Bedeutung erscheinen während der Skelettmyoblastendifferenzierung im Vergleich zu anderen miRNAs, iv) die Häufigkeit der Zieltranskripte und beeinflussten biologischen Prozessen miRNA-spezifisch war und v) miRNA-Untergruppen kollektiv die Genexpression regulieren mögen.

Schlussfolgerungen:
Die integrative Analyse von mRNA und miRNA Profildaten erhöhte die Prozessspezifität und Qualität der vorhergesagten Beziehungen durch die statistische Selektion der miRNA-Zieltranskriptwechselwirkung. Desweiteren offenbarte diese Studie miRNA-spezifische vorherrschende biologische Bedeutungen in der Skelettmuskelzelldifferenzeirung und in der Antwort auf TNF- oder IGF-Behandlung. Außerdem wird vorgeschlagen, dass Myoblastendifferenzierungs-assoziierte miRNAs kollektiv Gengruppen und Zieltranskripte regulieren, die mit angereicherten spezifischen Genontologietermini oder Signalwegen verbunden sind. Vorhergesagte miRNA-Funktionen dieser Studie stellen neue Erkenntnisse zur Verfügung in der defekten Regulierung der Transkriptomebene während der Myozytenproliferierung und –differenzierung bedingt durch inflammatorische Einflusse.

Tumornekrosisfaktor alpha und Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor 1 induzierte Modifikationen der Genexpressionskinetiken der differenzierenden Skelettmuskelzellen.
Tumor necrosis factor alpha and Insulin-like growth factor 1 induced modifications of the gene expression kinetics of differentiating skeletal muscle cells.
Meyer, S.U.; Krebs, S.[12]; Thirion, C.[13]; Blum, H.16; Krause, S.[14]; Michael W. Pfaffl, M.W.:
Plos One (Published: October 8, 2015)

Einleitung:
Die TNF-? Werte sind während des Muskelschwundes und chronischer Muskeldegenerierungs- und Muskelregenerierungsprozesse erhöht, was charakteristisch für primäre Muskelkrankheiten ist. Pathologisch erhöhte TNF-? Werte haben einen negative Einfluss auf die Effizienz der Muskelzelldifferenzierung, wohingegen IGF1 einen positive Effekt haben kann; daher war es unsere Absicht den Einfluss von TNF-? und IGF1 auf die Genexpression während der frühen Phasen der Skelettmuskeldifferenzierung aufzuklären. 

Methodik/Hauptergebnisse:
Diese Studie präsentiert Genexpressionsdaten von murinen Skelettmuskelzellen, PMI28, während der myogenen Differenzierung oder Differenzierung mit TNF?- oder IGF1-Behandlung bei 0 h, 4 h, 12 h, 24 h, und 72 h nach Induzierung. Unsere Studie detektiert signifikante Koregulierung von Genzusammenstellungen, die in der Myoblastendifferenzierung oder in der Antwort auf TNF-? involviert sind. Genexpressionsdaten offenbarten eine zeit- und behandlungsabhängige Regulierung der Signalwege, die bedeutend sind in der myogenen Differenzierung. Wir identifizierten eine Anreicherung von Signalwegen, die nicht spezifisch in Verbindung gebracht wurden mit Myoblastendifferenzierung wie beispielsweise Doublecortin-ähnliche Kinaseweg Assoziierungen sowie Anreicherung von spezifischen Semaphorinisoformen. Zudem ist dies nach unserem Wissen die erste Beschreibung einer inversen Regulierung der folgenden Gene in der Myoblastendifferenzierung und Antwort auf TNF-?: Aknad1, Cmbl, Sepp1, Ndst4, Tecrl, Unc13c, Spats2l, Lix1, Csdc2, Cpa1, Parm1, Serpinb2, Aspn, Fibin, Slc40a1, Nrk und Mybpc1. Wir identifizierten eine Unterguppe an Genen (Nfkbia, Nfkb2, Mmp9, Mef2c, Gpx, und Pgam2), die stabil durch TNF-? reguliert wurde über unabhängige myogene Differenzierungsstudien hinweg.

Schlussfolgerungen:
Dies ist der größte Datensatz, der den Einfluss der TNF?- oder IGF1-Behandlung auf die Genexpressionskinetiken der frühen in vitro Skelettmuskeldifferenzierung offenbart. Wir identifizierten neue mRNAs, die noch nicht mit der Skelettmuskeldifferenzierung oder der Antwort auf TNF-? in Verbindung gebracht wurden. Die Ergebnisse dieser Studie mögen das das Verständnis der Transkriptomnetzwerke, die der inhibierten Muskeldifferenzierung in inflammatorischen Krankheiten zugrunde liegen, fördern.

Entwicklung eines Biomarkermusters in bovinem Herz- und Lungengewebe zur Detektion des Missbrauchs verschiedener anaboler Wachstumsförderer
Development of an uniform biomarker signature in bovine heart and lung to detect the abuse of different anabolic growth promoters
Riedmaier, I.; Spornraft, M.; Börger, N.; Schiemann, I.; Pfaffl, M.W.: (2015) Journal of Nutritional Health and Food Science 3(3): 1-8

Die Verabreichung wachstumsfördernder Substanzen in der Tiermast ist für die Landwirte ökonomisch sehr attraktiv. Aufgrund von Nebenwirkungen für den Konsumenten verursacht durch Substanzrückstände gibt es in der EU ein Verbot des Gebrauchs von Wachstumsförderern, welches streng kontrolliert wird. Neu entwickelte Xenobiotika und unbekannte Verabreichungswege, wie zum Beispiel die Gabe von Hormoncocktails sind bisher schwer aufzudecken. In der Erforschung alternativer Detektionsmethoden ist die Entwicklung molekularer Biomarker in den Fokus des Interesses gerückt.

In diesem Kontext hat sich die Identifizierung von Biomarkern auf Transkriptom-Ebene als viel versprechend gezeigt. In Kälberleber konnte bereits eine mRNA Biomarkersignatur für die Behandlung mit Clenbuterol oder Progesteron plus Östradiol Benzoat identifiziert werden. In der aktuellen Studie wurde die mRNA Expression in Herz und Leberproben, welche aus demselben Versuch gewonnen wurden untersucht um zusätzliche Biomarker zu identifizieren.

Zu untersuchende Kandidatengene wurden durch Literaturrecherche nach bereits bekannten Wirkungen der verabreichten Substanzen auf das jeweilige Gewebe ausgewählt und deren Expression wurde mittels RT-qPCR quantifiziert. 

Zur Identifizierung eines mRNA Biomarkermusters welche eine Trennung von unbehandelten und behandelten Tieren ermöglicht wurde die dynamische Hauptkomponentenanalyse (PCA) angewendet. In Herzgewebe konnte eine Signatur von 22 Genen für Steroidbehandlung und 12 Gene für Clenbuterolbehandlung identifiziert werden. In Lungengewebe zeigte sich eine Signatur aus 4 Genen für Steroidbehandlung und 8 Genen für Clenbuterolbehandlung als erste Biomarker. Nachdem die Zuordnung zu den Behandlungsgruppen in beiden Geweben nicht optimal war, wurde eine integrative Datenanalyse angewendet indem die Ergebnisse aus Herz und Lunge gemeinsam ausgewertet wurden. Dabei zeigte sich eine Signatur aus 17 Genen als geeignet zur Separation von Kontrolltieren und Steroid behandelten Tieren und eine Signatur von 9 Genen zur Separation von Kontrolltieren und Clenbuterol behandelten Tieren. Zusätzlich konnte eine Signatur von 23 Genen identifiziert werden, welche die Trennung von unbehandelten von behandelten Tieren unabhängig von der applizierten Substanz ermöglichte. 

Die Ergebnisse dieser Studie zeigen das große Potenzial der Entwicklung transkriptioneller Biomarker zur Aufdeckung der illegalen Anwendung Wachstumsfördernder Substanzen in der Tiermast.

Die Anwendbarkeit von zirkulierenden extrazellulären small RNAs (smexRNAs) in der veterinärmedizinischen Diagnostik - Identifikation molekularer Biomarker-Signaturen
The Potential of Circulating Extracellular small RNAs (smexRNA) in Veterinary Diagnostics – Identifying Biomarker Signatures by Multivariate Data Analysis.
Spornraft, M.; Kirchner, B.; Pfaffl, M.W.; Riedmaier, I.: Biomolecular Detection and Quantification (2015) 5: 15-22

Weltweit ist die Anwendung von wachstums- und leistungssteigernden Substanzen in der Tiermast eine Strategie, um die Produktivität zu steigern. In manchen Ländern wie auch in der gesamten EU sind diese Praktiken jedoch verboten, um die Verbraucher vor möglichen gesundheitlichen Risiken von Substanzrückständen in Lebensmitteln zu schützen. Um den wirtschaftlichen Profit zu maximieren, ist es für "schwarze Schafe" in der Landwirtschaft ein Anreiz, die Detektionsmethoden in den Routinekontrollen zu hintergehen. Deshalb ist eine innovative, verlässliche und betrugssichere  Nachweismethode eine dringende Notwendigkeit. Die Analyse des Transkriptoms (Transkriptomics) stellt dabei einen neuartigen Ansatz dar, um veterinärmedizinische Biomarker zu entdecken. Wegen der erhöhten Stabilität und der einfachen Beprobung wurden zirkulierende extrazelluläre small RNAs (smexRNAs) aus Rinderplasma isoliert und sequenziert, sowie ihre Anwendbarkeit als Biomarker-Kandidaten mittels multivariater Datenanalyse evaluiert.

Nach Programmierung einer Datenanalyse-Pipeline konnten die microRNA (miRNA) und PIWI-interacting small non-coding RNA (piRNA) Konzentrationen im Plasma berechnet werden. Außerdem wurden Signaturen der hoch exprimierten small RNAs erstellt, um zu zeigen, dass die Readcount-Datensätze stark von den Top10 small RNAs repräsentiert wurden. Zur Evaluierung einer möglichen Anwendung von multivariaten Datenanalysetools, um Tiere nach einer Behandlung mit veterinärmedizinischen Substanzen zu identifizieren, wurde OPLS-DA mit den sequenzierten small RNA Datensätzen durchgeführt.

Die Qualität der diskriminierenden miRNA Modelle, bei denen alle sequenzierten Reads der beiden behandelten Versuchsgruppen (Kälber wurden mit Steroidhormonen oder mit dem ?-Agonist Clenbuterol behandelt) verwendet wurden, war deutlich gesteigert im Vergleich mit kombinierten piRNA Datensätzen. Die Verwendung von multivariaten Projektionsmethoden wie OPLS-DA zeigten das größte Potenzial diskriminierende Modelle auf miRNA-Basis zu generieren. Aufgrund der gezeigten vergleichenden OPLS Analysen kann festgestellt werden, dass die zirkulierenden miRNAs am besten geeignet waren, Biomarker-Kandidaten zu identifizieren, um Medikamentenmissbrauch in dieser Tierstudie aufzudecken.

[1] SIRION Biotech GmbH, 82152 Martinsried, Germany

[2] CNRS FRE 3377, Univ. Paris-Sud, CEA Saclay, iBiTec-S/ SBIGeM, F-91191 Gif-sur-Yvette, France

[3] Laboratory for Functional Genome Analysis (LAFUGA), Gene Center, LMU Munich, 81377 Munich, Germany; 

[4] Department of Statistics, Ludwig-Maximilians-Universität München, 80539 Munich, Germany; 

[5] Friedrich-Baur-Institute, Department of Neurology, Ludwig-Maximilians-Universität München, 81377 Munich, Germany

[6] Institute of Computational Biology, Helmholtz Center Munich, German Research Center for Environmental Health, 85764 Neuherberg, Germany; 

[7] Laboratory for Functional Genome Analysis (LAFUGA), Gene Center, LMU Munich, 81377 Munich, Germany

[8] Department of Statistics, Ludwig-Maximilians-Universität München, Ludwigstr. 33, 80539 Munich, Germany

[9] SIRION Biotech GmbH, 82152 Martinsried, Germany

[10] Friedrich-Baur-Institute, Department of Neurology, Ludwig-Maximilians-Universität München, 81377 Munich, Germany

[11] Department of Mathematics, Technische Universität München, Boltzmannstraße 3, 85747 Garching, Germany

[12] Laboratory for Functional Genome Analysis (LAFUGA), Gene Center, University of Munich, 81377 Munich, Germany;

[13] Sirion GmbH, Am Klopferspitz 19, Martinsried, Germany;

[14] Friedrich-Baur-Institute, Department of Neurology, Ludwig-Maximilians-Universität München, 81377 Munich, Germany;

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    Letzte Änderung: 08.06.2016